Exploring of the pathogenesis of intractable eosinophilic airway inflammation via eosinophilic exosome-derived miRNA

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K07457
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 小林 良樹 関西医科大学, 医学部, 准教授 (10375298)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神田 晃 関西医科大学, 医学部, 教授 (70375244)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 好酸球性エクソソーム / AXL

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、昨年度に抽出したmiRNA-432-5pのターゲットなる遺伝子について検証を行った。AXL、CARD8、GMNC、MAN1A2、NES、PPP1R18、DUSP16のmRNA発現レベルについて、好酸球性副鼻腔炎症例の活性化好酸球（末梢血分離好酸球）と共培養した気道上皮細胞で解析した。AXL、CARD8、PPP1R18、DUSP16の発現がコントロール（健常者）と比較して有意に低下していた。そのうち、AXLとCARD8のみにおいて蛋白レベルでも発現低下を確認することができた。
続いて、AXLとCARD8のsiRNAを用いたノックダウンモデル（気道上皮細胞）の作成に取り組んだが、AXLに関しては約40%までタンパクレベルを低下させることができた。CARD8に関しては現在も至適条件を検討している（siRNAを再デザインして検証中）。AXLノックダウンモデルを用いて好酸球性ムチンの溶解速度を検証したところ、有意にムチン溶解が遅延されることがわかった。さらに、本モデルを用いてステロイド感受性に関しても検証を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

活性化好酸球と共培養した気道上皮細胞における標的遺伝子の発現低下に対するエクソソーム放出阻害剤の影響の検討ができていない。
もう一つの標的遺伝子であるCARD8のノックダウンモデル（気道上皮細胞）の至適化が完了していないために、同モデルを用いた機能評価の検討ができていない。

Strategy for Future Research Activity

今年度の研究の主体は、診断補助や病勢マーカーとしての好酸球性エクソソーム由来miRNA測定方法を確立させることである。経口で吸気を行い、鼻から呼出して、口鼻マスクに接続した携帯型呼気凝縮液採取装置で呼気凝縮液を採取し、エクソソーム由来の標的miRNAの検出を行う。喘息合併ECRS症例から呼気凝縮液のサンプリングを行い、好酸球性エクソソーム由来miRNAの測定方法を確立させる。多量の好酸球性エクソソーム由来のmiRNAが含まれていることが予想される好酸球性ムチンの上清や健常コントロールの呼気凝縮液から得られるパターンと比較し、標的miRNAの疾患特異性や病勢マーカーとしての有用性について検証する。
同時に、AXLとCARD8のノックダウンモデルを用いた機能解析（気道上皮細胞における炎症性サイトカインの産生能やステロイド感受性など）も進めていく。
また、標的分子の活性化に基づいた新規治療薬の探索も行う。AXLやCARD8の活性化を指標として、天然化合物ライブラリーから新規治療薬やドラッグリポジショニングの可能性を探る。

Causes of Carryover

標的遺伝子のノックダウンモデルの至適化が遅れているために機能解析の実験も一部進んでいないことが次年度使用額が生じた主な要因である。siRNAの再デザインも済み、現在、至適化を行っているところである。ELISAキットなどを購入し、ノックダウンモデルにおける炎症性サイトカイン産生能についても解析を進めていく予定である。