Identification of the molecules that promote IgG-translocation across the BBB in autoimmune CNS diseases

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K07494
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 竹下 幸男 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (70749829)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: Blood-Brain Barrier

Outline of Annual Research Achievements

自己免疫性神経炎症疾患である視神経脊髄炎(NMOSD)や抗MOG抗体関連疾患は、標的分子に対する自己抗体による中枢神経系内での細胞障害が主な原因である。しかし、標的分子は血液脳関門（blood-brain barrier; BBB）を隔てた中枢神経系に発現しており、BBBを通過することのできない自己抗体がどのようにBBBを通過し標的分子を攻撃するのかという分子病態が不明であった。本研究では、我々が10年の歳月をかけて完成させた血液脳関門(BBB)を構成する3種類の主要構成ヒト細胞株を用いたin vitro BBBマルチ培養モデル（国内・海外特許申請済）と、自己免疫性神経炎症疾患の個別患者IgGを用いて、IgGの中枢移行を促進する血管内皮細胞の膜蛋白の標的抗原分子を同定し、抗体治療薬の脳内輸送をコントロールできる治療薬の開発を目的とする。
当初の予定通り、各20名のNMOSD,抗MOG抗体陽性関連疾患患者のIgGをIn vitroモデルに作用させ、IgGの中枢移行を誘導する検体を複数選定した。
さらに、血管内皮細胞株の膜蛋白と選定した患者IgGとで免疫沈降を行い、質量分析解析を行い、健常者群と比較し特異的な発現がみられた膜蛋白を標的抗原候補として同定した。
現在、同定した分子に対する中和抗体、発現抑制することでIgGの移行が促進されるか、亢進したIgG輸送がエンドソームによるtranscellularによるものかを検証中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予定通りの結果が出てきており、順調に進展している

Strategy for Future Research Activity

微小脳血管細胞株の膜蛋白をBiotin化させ、超円心法で膜分画を分離する。次に選定した患者IgGを、膜分画と共に磁気ビースに作用させて免疫沈降する。沈降物から精製した蛋白の質量分析を行い、健常者群と比較し質量ピーク出現頻度を指標としたS/B(患者由来/健常人由来)比で高値を示した膜蛋白を標的膜蛋白抗原候補として同定する。
培養した微小脳血管内皮細胞に発現している標的膜蛋白抗原候補を中和抗体またはsi-RNA法を用いて機能阻害または発現抑制させ、in vitroモデルIR-Dyeで標識したヒトIgGをマルチ培養モデルのHBMEC側に添加し、12時間後にLI-COR社製Odysseyイメージングシステムで移行量を測定し、IgGの移行促進が再現された候補分子を標的膜蛋白抗原分子として同定する。同時に細胞内エンドソームを免疫染色により可視化定量し、亢進したIgG輸送がエンドソームによるtranscellularによるものかを検証する。

Causes of Carryover

研究が順調で、一部の消耗品は少量で済んだため、少額の未使用額が生じた。