2022 Fiscal Year Research-status Report
高速原子間力顕微鏡を用いた凝集タンパクのクロス・シーディング効果の時空間的観察
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22K07514
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
小野 賢二郎 金沢大学, 医学系, 教授 (70377381)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | アルツハイマー病 / レビー小体病 / アミロイドβ蛋白 / αシヌクレイン蛋白 / 高速原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アルツハイマー病やレビー小体病（パーキンソン病、レビー小体型認知症）では、アミロイドβ蛋白(amyloid β-protein: Aβ)やαシヌクレイン蛋白(α-synuclein protein: αS)の単独あるいは混合で形成された凝集体が関与している可能性が示唆されている。これまでに我々は、AβあるいはαSの重合核(シード)を用いた凝集反応(セルフ・シーディング)を種々検討している。本研究では、AβとαSとの間での凝集反応(クロス・シーディング)の検討を行い、その凝集促進効果の有無や機序を明らかにすることを目的として研究を展開している。
AβとαSのセルフおよびクロス・シーディングにおいて、各蛋白のシードの調整法がその凝集反応速度に影響を及ぼす可能性が考えられることから、本年度では、まず、種々の方法でAβ42およびαSのシードを調整した。なお、Aβ42は市販のものを用い、αSは大腸菌より調整し精製たものを用いた。得られた各シードを用い、チオフラビンT(thioflavin T: ThT)を利用した系でセルフ・シーディングについて種々検討した結果、調整法により凝集反応に差がみられることを明らかにした。また、Aβ42のセルフ・シーディングについて、高速原子間力顕微鏡(high-speed atomic force microscopy: HS-AFM)を利用した凝集反応の動的観察も検討しており、シードの調整法や測定条件により凝集反応が大きく影響されることを明らかにした。次に、ThTを利用した系でAβ42とαSのクロス・シーディングを種々検討したところ、現在の条件ではクロス・シーディングの凝集促進効果が小さく、HS-AFMで評価可能な時間内で動的観察が困難であることが明らかとなり、シード調整や凝集反応の条件(緩衝液や塩濃度、pHなど)最適化が必要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Aβ42やαSのサンプル準備について検討したところ、それぞれのlow molecular weight(LMW)画分(主としてモノマーが存在する画分)とhigh molecular weight(HMW)画分(主としてプロフィブリルなどのオリゴマーが存在する画分)をサイズ排除クロマトグラフィーで効率的に分離することに成功した。得られたAβ42およびαSのLMW画分を用いて、37℃下で静置や振とう、攪拌などの条件で凝集反応を行い、超音波破砕して各シードを調整した。
上記で調整した各シードを用い、セルフ・シーディング(Aβ42シード＋Aβ42-LMW溶液、または、αSシード＋αS-LMW溶液)をThTを利用した系で種々検討したところ、凝集反応の反応速度が速いAβ42あるいはαSシードを見い出すことができた。Aβ42については、HS-AFMでセルフ・シーディングの動的観察を行うことができたが、αSについては現在反応条件を検討している。
次に、Aβ42とαSのクロス・シーディング反応(Aβ42シード＋αS-LMW溶液、または、αSシード＋Aβ42-LMW溶液)を検討した。ThTを利用した系でクロス・シーディングを種々検討したにもかかわらずクロス・シーディングの凝集反応を促進させる条件を見出すことができず、HS-AFMによる凝集反応の評価は検討できていない。この原因については次のように考えている。すなわち、Aβ42については、これまでと同様に市販のものをサイズ排除クロマトグラフィーで分離・精製したLMW画分を用いたが、αSについては、これまでと異なり大腸菌から調整したαSのLMW画分を用いており、このことがクロス・シーディングに大きく影響している可能性を考えている。また、αSシードを調整した際の緩衝液や塩濃度もクロス・シーディングに影響している可能性を考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Aβ42やαSの凝集反応（セルフおよびクロス・シーディング）にAβ42やαSのシードが大きく影響していることから、今後は、まず各シードの調整条件(用いる緩衝液や塩濃度、pHなど)について検討する。次いで、ThTを利用した簡便な系でクロス・シーディングの凝集反応が促進される条件を見い出し、HS-AFMによる凝集反応の動的観察を行うことを計画している。その後、Aβ40を用いて同様の実験を行い、Aβ42やAβ40、αS間でのクロス・シーディング効果を検討する。上記の実験がうまく行けば、種々のクロス・シーディングで形成された混合凝集体について、円偏光二色性(circular dichroism: CD)スペクトルで蛋白の2次構造を評価する予定である。
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| Causes of Carryover |
今年度予定していたαSの凝集の最適条件の検討に時間がかかり、そのため次段階の研究として当初予定していたAβとαSのクロス・シーディングの最適条件の検討にも時間を要したため、次年度使用額が生じた。本研究の基礎となるαSの凝集の最適条件の検討を最優先で行う予定である。
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Research Products
(29 results)
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[Journal Article] Decreased circulating branched-chain amino acids are associated with development of Alzheimer’s disease in elderly individuals with mild cognitive impairment2022
Author(s)
Ikeuchi T, Kanda M, Kitamura H, Morikawa F, Toru S, Nishimura C, Kasuga K, Tokutake T, Takahashi T, Kuroha Y, Miyazawa N, Tanaka S, Utsumi K, Ono K, Yano S, Hamano T, Naruse S, Yajima R, Kawashima N, Kaneko C, Tachibana H, Yano Y, Kato Y, Toue S, Jinzu H, Kitamura A, Yokoyama Y, Kaneko E, Yamakado M, Nagao K.
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Journal Title
Frontiers in Nutrition
Volume: 9
Pages: 1040476
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] An exploratory, open-label, randomized, multicenter trial of hachimijiogan for mild Alzheimer’s disease2022
Author(s)
Kainuma M, Ouma S, Kawakatsu S, Iritani O, Yamashita KI, Ohara T, Hirano S, Suda S, Hamano T, Hieda S, Yasui M, Yoshiiwa A, Shiota S, Hironishi M, Wada-Isoe K, Sasabayashi D, Yamasaki S, Murata M, Funakoshi K, Hayashi K, Shirafuji N, Sasaki H, Kajimoto Y, Mori Y, Suzuki M, Ito H, Ono K, Tsuboi Y.
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Journal Title
Frontiers in Pharmacology
Volume: 13
Pages: 991982
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Combined Treatment with Curcumin and Ferulic Acid Suppressed the Aβ-Induced Neurotoxicity More than Curcumin and Ferulic Acid Alone2022
Author(s)
Ohashi H, Tsuji M, Oguchi T, Momma Y, Nohara T, Ito N, Yamamoto K, Nagata M, Kimura AM, Kiuchi Y, Ono K.
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Journal Title
International Journal of Molecular Sciences
Volume: 23
Pages: 9685～9685
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Deterioration after disease modifying treatments in a patient with ATTRv amyloidosis (Leu58Arg)2022
Author(s)
疋島貞雄, 坂井健二, 山口浩輝, 柴田修太郎, 林 幸司, 中野博人, 兼元みずき, 碓井雄大, 谷口 優, 小松潤史, 中村-進藤桂子, 野崎一朗, 浜口 毅, 岩佐和夫, 山田正仁, 小野賢二郎
Organizer
第63回日本神経学会学術大会
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[Presentation] Leu58Arg(p.Leu78Arg)変異を有するATTRvアミロイドーシス症例の疾患修飾治療と長期経過についての検討2022
Author(s)
疋島貞雄, 坂井健二, 赤木明生, 山口浩輝, 柴田修太郎, 林 幸司, 中野博人, 兼元みずき, 碓井雄大, 谷口 優, 小松潤史, 進藤桂子, 野崎一朗, 濵口 毅, 岩佐和夫, 山田正仁, 小野賢二郎
Organizer
第9回日本アミロイドーシス学会学術集会
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