Detection of ALS origin with reference to calcium-binding proteins, those generate glial inflammation

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K07517
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 林 信太郎 九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (90312876)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山崎 亮 九州大学, 医学研究院, 准教授 (10467946) ; 小早川 優子 九州大学, 大学病院, 助教 (40733788)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 培養ミクログリア / カルレチニン / カルビンディン / パルブアルブミン / MCP1 / CCL2 / グリア性炎症惹起性

Outline of Annual Research Achievements

①研究計画書に基づき、カルシウム結合蛋白 (カルビンディン, CB; カルレチニン, CR; パルブアルブミン, PV)によるグリア性炎症惹起性の検証を以下の方法で行った。マウス株化ミクログリア6-3細胞 (COSMO BIO Co.LTD)を96ウェルプレートに播種した後、培養液にエンドトキシンフリーであることを確認したリコンビナント蛋白、CB、CR、PV (0, 1, 10, 100 nM)を添加しday1-3の各培養上清に含まれる17種類のケモカイン/サイトカイン（CXCL1, GM-CSF, IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, MCP1, MIP1a, MIP1b, TNF-α）をFirePlex-96 Key Cytokines (Mouse)Immunoassay panel (Abcam, ab235656)で測定した。測定前に各dayにおいて細胞をパラフォルムアルデヒド固定しクリスタルバイオレット染色を行い、細胞の生存を確認した。この結果、測定した全項目の中で100 nM、day3のCR添加群においてMCP1の有意な増加を認めた (測定値は②に示す（pg/ml）。両側t検定；無添加群 vs. 100 nM: p=0.040, 1 nM vs. 100 nM: p=0.033, 10 nM vs. 100 nM: p=0.045)。残り16項目のケモカイン/サイトカインについて有意な変動はなかった。 CB、PV添加群では一部の検体で測定値が得られたがばらつきが大きく判定不可とした。
②(無添加群)118.4±21.8,　(1nM)177.6±20.9, (10nM)190.0±25.1, (100nM)328.5±79.2

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CB、CR、PVの単独添加によるグリア性炎症惹起性の検証を遂行できた。現段階で左記３種類のカルシウム結合蛋白のうち２種類を組合わせての同時添加実験、3種類を全て組合わせた同時添加実験は未施行であるが、実験方法は確立しているので時宜により円滑に施行可能である。

Strategy for Future Research Activity

1) 今回選んだCB、CR、PVはいずれもヒト正常脊髄前・側索を走行する軸索に存在が確認されているカルシウム結合蛋白である。ALSでは同領域の軸索変性が指摘されているので、今回培養ミクログリアからMCP1を産生させたCRがグリア性炎症を惹起するとの我々の仮説の信頼性を高めるために、他の軸索蛋白では同反応が見られないことを示す必要がある。このために代表的な軸索蛋白であるニューロフィラメントを添加した実験を施行する。
2) 研究計画書に基づき、２年度目はヒト脳脊髄液中のCB、CR、PV各濃度とケモカイン/サイトカイン濃度との相関関係の検証、マウス脳室内への蛍光標識カルシウム結合蛋白投与実験へと進む。

Causes of Carryover

理由：研究計画の一部であるマウス脳室内へのカルシウム結合蛋白投与実験について、投与蛋白群に蛍光標識をする行程のみならず、使用するカラムなど消耗品の全てをエンドトキシンを含まない状態にする必要があり（エンドトキシンが含まれていると脳室内投与自体が上手くいっても、動物がショック死を起こす可能性がある）、これらに対する費用が当初の予定と異なり当該年度に受領した経費を上回ってしまうことが判明した。このため当該年度の予算を次年度に繰り越し合算することにより、当実験に必要な予算を調達する計画に変更した。一方、この場合に当該年度については研究計画書に記した実験をほとんど行えなくなってしまうので、これを回避するために方策を講じた結果、教室が保存している培養ミクログリアとELISAキット、リコンビナント蛋白の供与を受ければ実験の遂行が可能であることが分かった。この方策によって現状で可能な実験を遂行し得たのみでなく、次年度に繋がる結果まで出すことが出来た。
使用計画：ヒト脳脊髄液中のカルシウム結合蛋白濃度やケモカイン/サイトカイン濃度測定のためのELISAキット、それに関する試薬の購入、マウス脳室内へのカルシウム結合蛋白投与実験のためのマウス、投与ペプチドや手術器具の購入、エンドトキシンフリー化処置、免疫染色のための試薬や抗体、培養実験のための培地の購入のために費用を用いる。

Research Products

• [Journal Article] Distinct effects among calcium-binding proteins for microglia to produce chemokines associated with the clinical severity of ALS. (2023)
  • Author(s): Hayashi S, Yamasaki R, Kira JI, Isobe N.
  • Journal Title: Clin Exp Neuroimmunol Volume: 14 Pages: -
  • DOI: 10.1111/cen3.12738
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The first evaluation of calretinin in the spinal axons encompassed in anterolateral funiculi outside the cortical tract and cerebrospinal fluids of ALS patients. (2022)
  • Author(s): Hayashi S, Yamasaki R, Kobayakawa Y, Kira JI, Isobe N.
  • Journal Title: Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener Volume: 23 Pages: 101-102
  • DOI: 10.1080/21678421.2022.2120682
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The first evaluation of calretinin in the spinal axons and cerebrospinal fluids of ALS patients. (2022)
  • Author(s): Hayashi S, Yamasaki R, Kobayakawa Y, Kira JI, Isobe N.
  • Organizer: 第63回日本神経学会学術大会
• [Presentation] カルシウム結合蛋白に着目したミクログリアからの 筋萎縮性側索硬化症重症度関連ケモカイン放出因子の解明. (2022)
  • Author(s): 林信太郎、山﨑亮、吉良潤一、磯部紀子.
  • Organizer: 第34回日本神経免疫学会学術集会
• [Presentation] The first evaluation of calretinin in the spinal axons encompassed in anterolateral funiculi outside the cortical tract and cerebrospinal fluids of ALS patients. (2022)
  • Author(s): Hayashi S, Yamasaki R, Kobayakawa Y, Kira JI, Isobe N.
  • Organizer: 33rd International Symposium on ALS/MND
  • Int'l Joint Research