2022 Fiscal Year Research-status Report

双極性障害における細胞内カルシウム恒常性異常と時計遺伝子の関連解析

Research Project

Project/Area Number	22K07613
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	上村拓治山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (60377497)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	双極性障害 / 時計遺伝子 / CLOCK / BMAL1 / GSK3β / リチウム
Outline of Annual Research Achievements	双極性障害患者では、細胞内ストレスシグナル伝達を担うカルシウムの恒常性異常を認め、『カルシウムチャネルの機能障害』が示唆されているが、双極性障害における躁、うつといった病相の周期的変化や日内変動といった特徴的な病態（『長期周期性を伴う概日リズム異常』）との関連性はまだ十分に解明されていない。本研究は、①細胞内カルシウムの恒常性異常、②気分安定薬であるリチウムの作用機序（GSK3β阻害作用）、③周期性の長期化を伴う時計遺伝子の発現変動、これらを融合させた分子遺伝学・薬理学的機能解析を行うことによって、双極性障害の発症機序を解明することを目的としている。本年度は、リチウムと機能的関連のある時計遺伝子の同定およびリチウム投与時の発現変動を確認し、以下の研究結果を得ることができた。１）リチウムと機能的関連のある時計遺伝子の同定：YKG-1細胞を用いて、概日リズムを担う時計遺伝子であるCLOCK、BMAL1の発現をqRT-PCRで確認した。その後、1mM LiCl長期投与（7日間）時のこれらの遺伝子の発現変動を評価した。1mM LiClの長期投与により、CLOCKおよびBMAL1ともにRNAレベルでの発現が上昇していた。発現の上昇率は、CLOCKよりもBMAL1の方が大きかった。２）リチウムはGSK3β阻害作用を有している。GSK3βとCLOCKおよびBMAL1の関連を確認するために、RNAiベクターによってGSK3βの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株を用いて、CLOCKおよびBMAL1の発現を確認した。BMAL1の発現は上昇していたが、当初の予期と反して、CLOCKの発現量は減少していた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason LiCl長期投与（7日間）によって、CLOCKおよびBMAL1の発現は上昇していたが、その上昇率は、CLOCKに比べてBMAL1の方が大きいことがわかった。リチウムはGSK3β阻害作用を有している。CLOCKおよびBMAL1とリチウムとの関係性を確認するために、GSK3βの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株を用いて、CLOCKおよびBMAL1とGSK3β相互作用を確認したところ、BMAL1の発現は上昇していたが、CLOCKの発現量は減少しているという当初予期していない知見を得た。CLOCKおよびBMAL1は、GSK3βの発現量に影響を受けるだけでなく、GSK3βの（脱）リン酸化などの影響も受けていることが示唆された。過去の文献を検索しながら、今回の研究で得られた知見の妥当性を検討する必要性を認めた。
Strategy for Future Research Activity	１）前年度に得られたGSK3βと関係性を認めるCLOCK、BMAL1の発現変動をリン酸化も含めたタンパクレベルでも確認をする。また、WST-8を使った細胞増殖率の測定、蛍光プローブを用いた細胞内Ca2+動態の測定を行う。その上で、過去の文献を調べながら、得られた知見の再検討を行う。２）CACNA1C、時計遺伝子（CLOCKおよびBMAL1など）の遺伝子間相互作用の解析：ⅰ） CACNA1Cの発現変動確認：YKG-1細胞におけるリチウム長期投与時におけるCACNA1Cと時計遺伝子（CLOCKおよびBMAL1など）の発現変動の関連をqRT-PCR、ウエスタンブロットを用いた定量的な検証およびWST-8による細胞増殖率の測定を行う。また、細胞内Ca2+動態を蛍光プローブFura2AMで確認する。ⅱ）CACNA1Cが安定にknock downしているYKG-1細胞株［申請者によって既に作成済み］を用いて、上記と同じ実験を行い、遺伝子間相互作用を確認する。
Causes of Carryover	本年度の研究で、RNAレベルではあるが、リチウムの長期投与によってCLOCKおよびBMAL1の発現が上昇していることがわかった。また、GSK3βの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株において、CLOCKおよびBMAL1の発現を確認したところ、BMAL1の発現は上昇しているが、CLOCKの発現量は減少しているといった予想外の知見が得られた。新型コロナウイルス感染症の拡大および試薬品価格の高騰もあり、解析方法も再検討しているが、過去の文献を検索しながら、今回の研究で得られた知見の妥当性を多角的に検証する必要性があり、次年度へと繰り越し、使用額の変更が生じた。