2022 Fiscal Year Research-status Report

甲状腺乳頭癌における放射性ヨウ素治療抵抗性メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	22K07668
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	松瀬美智子長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 助教 (30533905)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	甲状腺癌 / 放射性ヨウ素 / TERT
Outline of Annual Research Achievements	今年度はまず適切な症例を選別し、RAI治療反応症例と、抵抗性症例の収集を開始した。長崎大学病院及び長崎医療センターより検体の提供を受けた。日本核医学会の指針によると、RAI治療抵抗性は以下のように定義される。甲状腺全摘後の患者で、1-2週間の厳密なヨウ素制限を行い、TSH値が十分に上昇した状態で放射性ヨウ素I-131が投与され、かつ、下記のいずれかに該当する場合。（1）全身シンチグラムで放射性ヨウ素の集積が全く認められないか、極めて淡い集積しか示さない病変が存在する。（2）放射性ヨウ素の集積が良好であるにも関わらず、3-4回のRAI治療後に増大あるいは増加を示す病変が存在する。これに従い、RAI治療抵抗性症例を抽出した。今年度は（1）（2）に適合する症例と、コントロールとしての治療反応症例を合計26症例収集した。甲状腺全摘後に残存する正常甲状腺濾胞細胞を除去する目的でのアブレーションやアジュバント症例は除外し、転移病巣・再発腫瘍に対する治療を対象とした。TERT-p変異は年齢と強い相関があり、高齢者で陽性となる症例が多いため、年齢を一致させた症例を抽出した。抽出した症例の手術検体（凍結組織又はFFPE検体）より、それぞれ腫瘍部分と対応する正常部分のDNA・RNAを抽出した。FFPE検体はAllPrep DNA/RNA FFPE（Qiagen）を用い、凍結組織はISOGENを用いた。TERT-p変異の検出には核酸蛍光プローブとdroplet digital PCRを組み合わせ、高感度にTERT-p変異を検出できる方法を用いる予定であり、これまでのところ、解析に十分な量の核酸を抽出することができている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 適切な症例を選別し、検体を収集することができている。
Strategy for Future Research Activity	RAI治療に対する抵抗性とTERT-p変異との関連引き続き症例の選別・収集を行い、RAI治療反応症例と、抵抗性症例をそれぞれ40例ずつ収集し、TERT-p変異とヨウ素の取り込み、治療効果との関連を詳細に検討する予定である。 RAI治療抵抗性メカニズムの解明前述したRAI治療抵抗性の定義によると、RAI治療抵抗性のメカニズムとして、（1）はヨウ素取り込みに関連する遺伝子の発現低下や機能異常によるものと考えられ、（2）は甲状腺癌細胞の放射線耐性によるものと考えられる。以下の検討によって、RAI治療抵抗性の分子メカニズムを明らかにする。（1）甲状腺細胞にヨウ素が取り込まれる際、ヨードトランスポーター（sodium iodide symporter: NIS）を使って細胞内に取り込まれることが分かっている。ヨウ素取り込みに関連する遺伝子の発現低下については、臨床サンプルを用いて、NISの発現量と、放射性ヨウ素の集積量、TERT-p変異との関連について検討する。（ヒト甲状腺細胞株は正常も含め、すでにNISの発現を失っており、細胞株での検討は難しいことがわかっている。）（2）甲状腺癌細胞の放射線感受性については、甲状腺癌細胞株においてsiRNAによるTERTノックダウン、もしくはCRISPR/Cas9等でTERT-p変異を導入（またはwild-typeへ置換）し、放射線感受性の変化を検討する。TERTは、変異アレルからのみ発現することが報告されているため、変異アレルのコアプロモーター領域をCRISPR/Cas9でノックアウトすることで、TERTの発現をなくすという方法も検討する。これらの細胞に放射線を照射し、放射線感受性、DNA損傷応答分子の動態、DNA修復能（g-H2AX）などをコロニー形成アッセイ、ウエスタンブロット、蛍光免疫染色を用いて比較検討する。
Causes of Carryover	今年度はまず症例の選定作業を行い、検体の収集を主に行なったため、核酸抽出、変異解析のための予算を使用しなかった。次年度に核酸抽出、変異解析のための試薬の購入に充てる予定。