2022 Fiscal Year Research-status Report
低ホスファターゼ症病態形成新規メカニズム－細胞外リンのシグナル及びATPの関与－
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22K07837
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| Research Institution | Osama Woman's and Children's Hospital |
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Principal Investigator |
山崎 美和 (若林美和) 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 骨発育疾患研究部門, 流動研究員 (50455549)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | TNSALP / Phosphate |
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| Outline of Annual Research Achievements |
組織非特異型アルカリホスファターゼ（TNSALP）は骨芽細胞などの形質膜に存在するectoenzymeであり、ピロリン酸などの基質を分解して無機リン酸を産生する。低ホスファターゼ症 (HPP) はTNSALPをコードするALPL遺伝子の機能喪失に基づき、骨石灰化障害や乳歯早期脱落など多彩な症状を呈するが、病態形成機構は完全には理解されていない。本研究においては、健常人由来iPS細胞にCRISPR/Cas9によるゲノム編集を適用してALPL-knockout (KO)細胞を樹立し、骨芽細胞系列に分化誘導して解析することにより、HPPの病態形成機構を解明することを目的とした。
健常人由来iPS細胞株にALPLのexon 3とexon 4内の標的配列に対する合成guide RNAとCas9蛋白質を導入し、欠失およびフレームシフトが誘導されたクローンを選定した。ALPL-KOにおいてはTNSALP酵素活性は完全に喪失しており、一方、ALPL-hetero KOにおいてはALPL以外は遺伝的に同質なisogenic controlの半分程度の残存酵素活性を保持していた。リン酸供与体としてbグリセロリン酸を含む骨芽細胞分化誘導培地を用いて８週間まで培養し、経時的にアリザリンレッド染色を行ってin vitro石灰化能を評価したところ、ALPL-KOにおいては培養期間を通じて石灰化が著明に抑制されていた。一方、ALPL-hetero KOにおいては、培養２週目以降、isogenic controlと同等の石灰化を示した。興味深いことに、分化誘導時、ALPL-KO iPS細胞では石灰化の障害にも関わらず、isogenic controlに比しRUNX2やosteopontinの発現が増加していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR/Cas9を適用しALPL欠損ヒトiPS細胞（HPPモデル細胞）を作製した結果、ALPL-KOクローン、ALPL-hetero KOクローンが得られ、骨芽細胞への分化誘導系による性状解析で興味深い結果が得られているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞外リン酸濃度の上昇はFGF受容体のリン酸化やRaf/MEK/ERK経路の活性化を引き起こし、AlplやCyclin D1、Dmp1などのリン酸応答遺伝子の発現を制御する。そこで、HPPモデル細胞及びコントロール細胞を骨芽細胞に分化誘導し、細胞外リン酸濃度の測定、FGF受容体のリン酸化やRaf/MEK/ERK経路の解析、リン酸応答遺伝子の発現の解析を進める。またHPPモデル細胞を筋細胞へと分化誘導し、遺伝子発現や蛋白質発現を検討する。
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| Causes of Carryover |
当該年度はWEB開催の学会が多かったため旅費の節約が可能となった。次年度は樹立したHPPモデル細胞の筋細胞への分化誘導を予定しており、試薬も高価なためまとまった予算が必要となり、次年度分の請求助成金と合わせて使用する予定である。
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