2022 Fiscal Year Research-status Report
インプリンティング異常症エピ変異の病態およびDNAメチル化維持機構の解明
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22K07858
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| Research Institution | National Center for Child Health and Development |
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Principal Investigator |
鏡 雅代 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 分子内分泌研究部, 室長 (70399484)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
関田 洋一 北里大学, 理学部, 准教授 (20431950)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | インプリンティング異常症 / DNAメチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
片親性発現するインプリンティング遺伝子の発現異常は、インプリンティング異常症 (ID) を引き起こす。インプリンティング遺伝子の発現は、インプリンティング領域内のメチル化可変領域 (DMR) により制御される。DMR のメチル化異常であるエピ変異はID を引き起こすが、その機序は不明である。また、エピ変異症例の一部には複数のDMR の脱メチル化を示すmultilocus imprintingdisturbance (MLID) 陽性例が存在するが、MLID原因遺伝子変異が同定されるのは少数である。本研究は、我々が集積しているIDs 症例の生体試料を用いた解析によりID のエピ変異およびMLIDに対する病態解明研究と、近接性標識法(Proximity labeling: PL) を用いて既知のDMR メチル化維持因子とともに働く新規タンパクを同定する基礎研究から構成される。病態解明研究では、新しく同定されたDMR メチル化維持因子であるZNF445 および既知メチル化維持因子遺伝子変異が影響するDMRを検討し、臨床像と関連を調べる。次いで、ZNF445 だけが結合するMEG3/DLK1:IG-DMR の脱メチル化により生じるTemple 症候群(TS14) エピ変異にZNF445遺伝子変異もしくはZNF445 結合領域の構造異常が関連するかを全ゲノムシーケンスで検討する。基礎研究では、DMR メチル化維持に必須のZFP57, ZNF445, KAP1 の近傍に存在するタンパクをPL にて抽出し、LC-MS/MS でスクリーニングし、これらのタンパクが片親性にDMR に結合するかを、母由来のみのゲノムに由来するマウスES細胞 (parthenogenesis ESCs) でのChIP 解析で確認し、DMR メチル化維持に関係する新規共役因子を同定する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
病態解明研究では、DMRメチル化維持機構の破綻が予想されるMLIDの集積を進め、29症例を集積し、全例に変異解析を施行した。児に病的バリアントがあることによりMLIDを発症する新規MLID原因遺伝子であるZNF445病的バリアントに加え、母に卵子のメチル化維持に必要なsubcortical maternal complex (SCMC)を構成するタンパクをコードする遺伝子であるNLRP2、PADI6などの変異を認め、合計４例で既知原因遺伝子の病的バリアントを同定した。病的バリアント陽性症例に対し、アレイを用いた網羅的メチル化解析を施行したが、低メチル化を示すDMRが多いという傾向を認めたが、共通して異常を示すDMRはなく、異常メチル化を示した領域と臨床像との関連性が示唆された。新しく同定されたDMR メチル化維持因子であるZNF445だけが結合するMEG3/DLK1:IG-DMR の脱メチル化により生じるTemple 症候群(TS14) エピ変異症例において、ZNF445遺伝子変異を施行したが、病的バリアントは今のところ同定されていない。基礎研究では、ZFP57, ZNF445, KAP1のcDNAとこれらのタンパクの近くにいるタンパクに対し近接性表示を行うTURBO-IDを搭載したコンストラクトを作成し、配列の確認を行った。現在、ヒト由来細胞へのトランスフェクションおよび培養を施行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度中にLC-MS/MS でスクリーニングを行い、ZNF445、ZFP57、KAP1とともに働く共役因子候補を抽出する。ZNF445に関しては、ZNF445のホモのナンセンス変異をもつ症例のiPS細胞を樹立済みである。正常iPS細胞も樹立済みであり、候補タンパクの発現量やRNAの発現量の評価に用いることで、さらなる研究の推進を進めたい。
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| Causes of Carryover |
近接性ラベリング法を用いたZNF445、ZFP57,KAP１近傍のタンパクを集め、LC-MS/MS法を用いて定量する予定であり、外注のための予算を計上していたが、ベクター構築に時間がかかり、タンパク定量まで到達しなかったため、翌年度に繰り越し、2023年度に施行予定である。
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