2022 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of mitochondrial function and cell action potential in iPS-derived neurons with DNM1L mutation
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22K07926
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
松本 浩 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (00536229)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大澤 郁朗 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究副部長 (30343586)
鈴木 郁郎 東北工業大学, 大学院工学研究科, 教授 (90516311)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | DNM1L / ATP産生 / 神経細胞 / 細胞外フラックスアナライザー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Dynamin 1-like (DNM1L)は、細胞内のミトコンドリア分裂を制御するDRP1をコードする核遺伝子である。2007年にDNM1Lヘテロ接合性変異による早期乳児致死性疾患が、ヒトにおける疾患として初めて報告された。DNM1Lのミスセンス変異は、DRP1のミトコンドリア周囲への集合および高次アッセンブリーに影響を与え、ミトコンドリア分裂を阻害することが報告されているが、最終的に神経細胞にどのような影響を及ぼすかは明らかとなっていない。今回の研究では、患者由来iPS細胞から神経細胞へ分化誘導を行い、DNM1L変異を有する神経細胞におけるミトコンドリア機能を酸素消費速度、ATP産生能、ミトファジーおよび細胞活動電位など、多面的に評価することを目的とした。
まずDNM1L変異を有する神経細胞において、ミトコンドリアのATP産生能の非侵襲的評価（細胞外フラックスアナライザー）を行った。OROBOROS O2k-FluoRespirometerは生細胞の酸素消費速度を測定可能であり、コントロールおよびDNM1L変異細胞において酸素消費速度を行ったところ、DNM1L変異細胞において酸素消費速度の低下を認めた。
次にMaLion (monitoring ATP level intensity based turn on indicators)によるATP産生能の非侵襲的評価を行った。MaLion は蛍光蛋白質であり、細胞内ATP濃度依存性に蛍光を発し、生細胞において視覚的にATP産生能を評価することが可能である。コントロールおよびDNM1L変異細胞にMaLionをトランスフェクションし、ATP産生能の評価を行ったが、両者において明らかな蛍光強度の差は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今回の研究計画では、患者由来iPS細胞から神経細胞へ分化誘導を行い、神経細胞におけるミトコンドリア機能を酸素消費速度、ATP産生能、ミトファジーおよび細胞活動電位など、多面的に評価することを予定していた。2022年12月に研究代表者の異動があり、新しい環境において引き続き研究を進めるための事務的手続きおよび機材のセットアップ、研究チームの編成などに時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策については、神経細胞における損傷ミトコンドリアのミトファジーの評価ならびに微小電極アレイ（MEA: microelectrode array）を用いた神経細胞の活動電位の評価を行うことを計画している。ミトファジー評価については、mitophagy dyeを用いたコントロールおよびDNM1L変異神経細胞の通常の状態および薬剤負荷の状態におけるミトファジーの差を蛍光顕微鏡による観察で明らかにする。ミトコンドリア分裂能が低下したDNM1L変異細胞では、ミトファジーが低下していることを予想している。
また神経細胞の活動電位を評価するために、微小電極アレイ（MEA）を用いて行う。MEAは１個の神経細胞における自発的な活動電位を神経発火として記録し、機能的なシナプス結合によるネットワーク性の誘発応答活動を神経細胞同期発火として記録する。分化させた神経細胞を、培養プレート上へ播種し、維持培養を行ってから神経活動電位発火および同期発火を測定する。
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| Causes of Carryover |
2022年度は研究代表者の異動などもあり、計画通りに予算を使用することができなかった。またCOVID-19流行のため学術集会もオンラインが主体であり、旅費を使用することも少なかった。2023年度においては、物品費、旅費、その他で助成金を使用する予定であり、また顕微鏡などの設備備品も新たに購入予定である。
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