食道扁平上皮癌がん幹細胞における免疫逃避機構の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08000
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 夏井坂 光輝 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (80642446)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 須田 剛生 北海道大学, 医学研究院, 講師 (20447460) ; 前原 経 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (80836338)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 癌幹細胞 / 食道扁平上皮癌 / 免疫チェックポイント阻害剤

Outline of Annual Research Achievements

本邦においてもESCCに対して免疫チェックポイント阻害剤（nivolumab、pembrolizumab）が臨床の現場で使用可能となった。我々はこれまでの豊富なESCCに関する実験データ（DNAマイクロアレイ）、ESCC癌幹細胞のサンプルを用いて解析を行ったところ、CD24low/CD44high癌幹細胞においてPD-L1、PD-L2の発現が有意に増加していることを確認した。さらに、FGFR/Erk経路阻害剤（trametinib）により一部のCD24low/CD44high癌幹細胞は減少し、治療抵抗性は回復するが、残存したCD24low/CD44high癌幹細胞ではPD-L1、PD-L2の発現が有意に増加していた。FGFR/Erk経路阻害剤であるtrametinibと抗PD-1抗体の併用療法がESCC癌幹細胞を標的とした有効な新規治療法となり得る可能性が期待される。
本研究はESCC癌幹細胞におけるPD-L1、PD-L2の発現調節機構の解明、免疫チェックポイント阻害剤の効果を3次元培養、オーガノイド、マウス発癌モデルを用いて詳細に検証することを目的に遂行される。さらに、免疫チェックポイント阻害剤とFGFR/Erk経路阻害剤の併用療法の可能性をマウス発癌モデルにより検証する
令和4年度は複数のESCC細胞株（TE8、TE11、HCE4、T-TeRAS）を用いてオーガノイドを作成した。オーガノイドからCD24low/CD44high癌幹細胞と非癌幹細胞をセルソーターにより分離し、PD-L1、PD-L2の発現を確認したところ、CD24low/CD44high癌幹細胞においてPD-L1及びPD-L2の発現は有意に上昇していた。EMTを促進するTGF-β1、FGF2により処理した細胞ではCD24low/CD44high癌幹細胞が増加し、同実験系においてもPD-L1、PD-L2の発現が有意に増加した。ただ、TGF-β阻害剤の短期間の処理（48時間）ではCD24low/CD44high癌幹細胞におけるPD-L1、PD-L2の発現に有意な変化は認められなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初予定していた3次元培養による解析、DNAマイクロアレイによる解析が行えなかったためやや遅れていると評価した。

Strategy for Future Research Activity

FGF2で処理した細胞をDNAマイクロアレイにより網羅的に解析し、PD-L1、PD-L2発現調節に関与し得る経路を同定する。
複数のESCC細胞株（TE8、TE11、HCE4、T-TeRAS）を用いて3次元培養を行う。免疫染色（CD44、CD24、扁平分化マーカー、EMTマーカー、PD-L1、PD-L2）によりESCC癌幹細胞におけるPD-L1、PD-L2の発現を確認する。上記で同定された経路に関する免疫染色で評価する。
6週齢のC57BL/6マウスに4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) 100mg/L、2%プロピレングリコール飲用水を16週間与える。その後、通常の飲用水に戻し、8週後に屠殺する。形成された食道腫瘍を摘出し、免疫染色（PD-L1、PD-L2、CD44、CD24、扁平分化マーカー、EMTマーカー、免疫細胞マーカー）を行う。また、上記①-2)で同定された経路に関する免疫染色を行う。

Causes of Carryover

初年度に予定していたDNAマイクロアレイ、3次元培養が実施できなかったため次年度使用額が発生した。令和5年度に当該実験を実施する予定である。