2023 Fiscal Year Research-status Report
腸刷子細胞の２型免疫応答に関わるストレス応答因子 ATF5 の新規機能の解明
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22K08064
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
中野 春男 東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (60601870)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ２型免疫応答 / 腸刷子細胞 / ストレス応答因子 / 細胞分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
２型自然リンパ球が関わる２型免疫応答は、寄生虫に対する生体防御反応である一方、アレルギー疾患の主因でもあり、その制御機構の解明は急務である。申請者は、感染寄生虫を認識し2型免疫応答を惹起する腸刷子細胞を制御する新規因子としてATF5遺伝子に注目し、腸刷子細胞の分化に関わるATF5 の標的遺伝子や作用機序を明らかにすることを目的としている。
本年度は、腸刷子細胞分化に関わるATF5の標的遺伝子を明らかにすることを目的とした。前年度に確立した野生型、及びATF5欠損型の腸オルガノイド培養系を用いて、２型免疫応答を惹起するIL-13サイトカインを刺激して腸刷子細胞の分化を誘導した後、定量PCR実験により腸刷子細胞に発現する遺伝子を解析した。その結果、腸刷子細胞に発現する一部の生理活性物質や神経伝達物質に関連した遺伝子の発現量が、ATF5欠損型で増加傾向にあることが見出された。これらの遺伝子が腸刷子細胞におけるATF5の標的遺伝子の候補として得られた。Hemagglutinin（HA）エピトープタグをATF5に挿入したATF5-HAノックインマウスより腸オルガノイド培養を確立し、HA抗体を用いたクロマチン免疫沈降実験によるATF5の転写標的遺伝子の探索を可能とした。
ATF5タンパク質翻訳を正に制御しているeIF2αのリン酸化が腸陰窩のパネート細胞で特に生じていること、及びパネート細胞における抗菌ペプチド発現異常が腸刷子細胞による２型免疫応答を過剰に惹起することが報告されたため、ATF5欠損型マウス腸におけるパネート細胞の抗菌ペプチド遺伝子発現を定量解析した。その結果、２型免疫応答を惹起されたATF5欠損マウス小腸において抗菌ペプチド遺伝子の発現異常が見出された。パネート細胞の抗菌ペプチド発現異常もATF5欠損マウスの腸刷子細胞の過剰形成に関与していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
やや遅れている理由は次の通りである。
条件的ATF5欠損マウスを作製すべく、CRISPR/Cas9ゲノム編集によるATF5遺伝子へのloxP配列挿入実験を実施したが、ATF5遺伝子領域（エクソン２）へのloxP配列の挿入が確認できなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究計画の一つである条件的ATF5欠損マウスの作製について、目的とするATF5遺伝子領域へのloxp配列ノックインマウスは得られていないが、野生型やATF5欠損型、ATF5-HAタグノックインマウスからの腸オルガノイド培養系の確立に成功し、腸刷子細胞の分化に関与するATF5の機能を解析するツールを得ている。そこで次年度は、腸刷子細胞の分化に関わる転写因子ATF5の標的遺伝子と作用機序を明らかにすることを目的に、ATF5-HAノックイン腸オルガノイド培養を用いたクロマチン免疫沈降実験を行う。腸刷子細胞の分化誘導性サイトカインIL-13を刺激した野生型、ATF5欠損型腸オルガノイドよりRNAを調整し、定量PCR実験やRNA-seqによる遺伝子発現解析を行う。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由
条件的ATF5欠損マウスを作製すべく、CRISPR/Cas9ゲノム編集によるATF5遺伝子へのloxp配列挿入実験を行ったが、目的とするloxp挿入マウスを得られなかったため、条件的ATF5欠損マウスを用いた腸刷子細胞分化の評価実験を実施できなかった。
次年度使用額の使用計画
腸オルガノイド培養に必要な培地、増殖因子、マトリゲルの購入、及びクロマチン免疫沈降実験や定量PCR実験、RNA-seq解析を行うために必要な試薬の購入に使用する予定である。
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