動脈硬化発症プロセスにおける一酸化窒素修飾がもたらすエンドセリン受容体機能の検討

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08203
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 林 宏樹 大阪大学, 大学院医学系研究科, 寄附講座講師 (20813364)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中神 啓徳 大阪大学, 大学院医学系研究科, 寄附講座教授 (20325369) ; 島村 宗尚 大阪大学, 大学院医学系研究科, 寄附講座教授 (60422317)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: エンドセリン受容体 / 動脈硬化 / 翻訳後修飾

Outline of Annual Research Achievements

超高齢化社会とともに動脈硬化患者は増加しており、早期の治療介入または予防を目指すために動脈硬化の初期発症メカニズムの解明は重要である。エンドセリン受容体はGタンパク共役型受容体（GPCR）であり、動脈硬化初期段階における内皮機能障害との関連が報告されている。GPCRの重要なアダプター分子として知られているβアレスチンは炎症時に誘導される一酸化窒素により翻訳後修飾（S-ニトロシル化）されシグナルを調節し、GPCRシグナルを調節している。本検討においてエンドセリン受容体において慢性炎症により誘導される翻訳後修飾のもたらす機能調節について解析を行う。
In vitroでの解析のためHEK293細胞においてエンドセリン受容体の安定発現株の樹立を行った。プラスミドを細胞内に導入して、薬剤でのセレクションを行いHEK293エンドセリン受容体安定発現株を数クローン得た。エンドセリンで樹立した細胞を刺激し、ERKのリン酸化をウエスタンブロットで確認すると通常のHEK293より増強されたシグナルが得られた。また局在を免疫染色で確認した。安定発現しているエンドセリン受容体はFlagタグがあるため、Flag抗体により免疫染色を行うと、細胞膜に局在していることが確認できた。またエンドセリンで刺激を行うと細胞質に内在化した。このようにHEK293細胞で機能するエンドセリン受容体の安定発現株ができた。この安定発現株を用いて今後の解析を引き続き行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

HEK293細胞を用いてエンドセリン受容体の安定発現株の樹立に時間がかかってしまった。また翻訳後修飾を検出する試薬が販売中止になり、代替法の検討に時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

本年度樹立したHEK293エンドセリン安定発現株を用いて、iNOSと野生型またはニトロシル化を受けない変異型βアレスチンを用いてシグナルに与える影響について検討を行う。また血管内皮細胞HAECまたはBAECを用いて炎症性サイトカイン発現への影響を検討していく。

Causes of Carryover

HEK293安定発現株樹立の遅れと、翻訳後修飾の代替法に時間を要していたため多くの実験実施できなかったため。次年度においてこれらの実験の実施に使用予定である。