2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of pathogenesis of interactable lung diseases associated with dysregulated lipid metabolism
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22K08229
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
高宮 里奈 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任助教 (70365419)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋藤 充史 札幌医科大学, 医学部, 講師 (00768939)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 肺癌 / リピドミクス解析 / ミトコンドリア / 小胞体 / コリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、ホスファチジルコリンの分解からコリン合成経路に関わるリン脂質分解酵素PNPLA6の発現の高い、肺癌細胞株(A549、H157細胞)、乳癌細胞株(MDA-MB231細胞）、腎がん細胞株(HEK293細胞)を用い検証を行なった。
まず、PNPLA6の細胞内における発現について乳がん細胞株である検証を行なった。Immunocytochemistryを行った結果、PNPLA6の細胞内での発現は、小胞体であることが分かった。次に、細胞から、小胞体とミトコンドリアを分画しウェスタンブロットでPNPLA6の発現を検証した結果では、PNPLA6の発現は主にミトコンドリアであることがわかった。以上の結果よりPNPLA6の発現は主にMitochondria associated membrane(MAM)に発現している可能性が高いことが分かった。
次に、PNPLA6を欠損させた細胞株を作成した。HEK293細胞、MDA-MB231細胞で、non targetとPNPLA6 ノックアウト細胞の細胞増殖をWST-1 assayにより検証を行なった。HEK293、MDA-MB231細胞両者で、著しい細胞増殖の低下が認められた。そこでHEK293細胞を用い細胞周期をDouble Thymidine Blockを用いG1/S期に同調させさらに検証を行なった。その結果、ノックアウト細胞ではS期に入る時点で細胞周期が遅れていることが分かった。
HEK293細胞のnon targetとPNPLA6ノックアウト細胞を用い細胞内のコリン、グリセロホスホコリン（GPC）の産生量を検証したところ、ノックアウト細胞では、著しいコリン、GPCの低下が認められた。このことから、HEK293細胞の細胞内のコリン、GPCの産生はPNPLA6により調節されている可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
ノックアウト細胞の作製、PNPLA6酵素活性測定に必要な測定系を確立し、測定が可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の結果より、PNPLA6欠損HEK293細胞では、コリン、GPC の産生が著しく低下していることがわかった。この細胞を用い、さらにリピドミクス解析を行い、細胞膜脂質に影響がないか検証を行う。また、ミトコンドリア、ER、MAMに細胞小器官を分画し、リピドミクス解析を行うことにより、どの細胞小器官にPNPLA6の欠失が影響を与えるか検討をする。
PNPLA6の発現は、染色するとER、細胞小器官を分画するとMAMである可能性が高いことがわかった。そこで、PNPLA6の発現の高い、MDA-MB231細胞を用いMAMを分画しPNPLA6の発現部位を特定する検証を行う。
最近の報告より、PNPLA6の発現はP53の変異、欠失と伴いSysthetic lethalityがあること、また肺腺癌の新たながん抗原としてPNPLA6(S965C)の変異が報告されている。PNPLA6の変異は神経疾患や、網膜変性疾患で多数の変異が報告されているが、S965Cの変異に関しては報告がない。そこで、p53変異ある、なしで、様々な肺がん細胞、乳癌細胞株をわけ、PNPLA6の発現量について検証を行う。また、変異体については、PNPLA6ノックアウトHEK293細胞にPNPLA6(S965C)を過剰発現させ、野生型を過剰発現させた時の酵素活性能について細胞内のコリン、GPCを測定することにより判断する。
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| Causes of Carryover |
コロナ関係で、共同研究先への出張、国際学会の参加、国内学会の参加を見送ったため。
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Research Products
(3 results)
