2022 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of primary ciliary dyskinesia using conditional reprogramming culture
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22K08244
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
近藤 光子 東京女子医科大学, 医学部, 特任教授 (50178430)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 原発性線毛機能不全症 / 線毛細胞 / 細胞培養 / 線毛運動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
原発性線毛機能不全症（Primary ciliary dyskinesia; PCD）の診断は、遺伝子検査、鼻腔NO、線毛の電子顕微鏡による構造異常、高速ビデオを用いた線毛運動異常など複数の検査を用いて確認することが望まれている。しかし、線毛自体の解析は感染などによる線毛の２次的損傷後の異常との鑑別が問題になる。そのため培養細胞を用いることが海外では推奨され、欧州呼吸器学会のガイドラインにも取り上げられている。しかし、希少疾患のためもあり、本邦での培養細胞を用いた検討はほとんどなされていなかった。一方、気道上皮細胞の初代培養は、継代後の細胞増殖には限界がある。特に、疾患気管支から採取したPCDの気道上皮細胞は培養成功率が低い点も問題となっている。これらを解決するために、本研究ではConditional Reprogramming(CRC)法を用いて培養、解析することを目的とした。本年度は、PCD疑い症例に気管支鏡生検を行い、生検組織をプロテアーゼ処理で、上皮細胞を単離し、CRC法を用いて基底細胞を増殖させた。その後、これをTranswellに蒔き、コンフルエンスの後にAir-liquid interface法に置換して、更に１ヶ月にわたって培養を継続した。その結果、線毛細胞への分化を位相差顕微鏡で確認でき、さらに線毛の電顕、蛍光免疫染色、高速ビデオ撮影を実施中である。また線毛細胞が密集した部分ではパーティクルを載せて、その移動を追跡して粘液線毛クリアラスシステムも検討中である。臨床所見や遺伝子変異との関連づけを行い、一部の症例で遺伝子変異による線毛運動異常の違いを確認している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
培養方法はほぼ確立できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降は高速ビデオによる線毛運動の解析のための条件設定の改善をめざす。また日本人に最も多いDRC1遺伝子変異による症例において、CRC法で培養した細胞の線毛電顕、線毛におけるDRC蛋白発現消失を抗DRC抗体による免疫染色やWestern blottingで証明する。また培養細胞の線毛運動の解析を行い、その他の気管支拡張症やDPBとの違いを検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
線毛運動解析のための高速ビデオ装置の搬入設置、顕微鏡との調整に時間を要した。次年度はこの新しいシステムを用いた検討を行う予定であり、残高分も使用予定である。
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