癌抑制遺伝子BAP1を標的とした胸膜中皮種新規阻害薬の開発

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08294
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 細川 好孝 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60229193)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 太田 明伸 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30438048)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 悪性胸膜中皮腫 / 癌抑制遺伝子 / 遺伝子編集技術 / cDNAマイクロアレイ / BAP1

Outline of Annual Research Achievements

・悪性胸膜中皮腫はアスベスト曝露に関連して発症し、発病までの期間は約20-30年と長期に渡る。2000年から2039年までの40年間で、中皮腫患者の死亡者数は10万人を超えると予測されている。多くは進行した状態で診断され、化学療法や免疫チェックポイント阻害薬の併用療法が行われているが、その効果は極めて限定的である。悪性中皮腫では、癌抑制遺伝子であるp16INK4a ，NF2 ， BAP1に不活化変異が高頻度に検出される。本研究では、胸膜中皮細胞を用いて癌抑制遺伝子ノックアウト株を作成し、中皮腫の増殖・浸潤・転移に関わる細胞内分子および阻害化合物を同定し、新規診断マーカーや新規治療薬の候補分子を探索することを目的とした。
今回、ゲノム編集技術を利用して、胸膜中皮細胞株でBAP1ノックアウト株を樹立した。さらに、我々は、cDNAマイクロアレイ網羅的発現解析とリアルタイムPCR定量的解析によって、BAP1ノックアウト株で高発現する遺伝子群と低発現する遺伝子群を同定した。高発現遺伝子として、カルモジュリンキナーゼCAMK2Dが抽出された。
MTTアッセイによる細胞増殖阻害を指標として、400個小分子化合物ライブラリーを用いたBAP1ノックアウト株の予備的なスクリーニング実験を実施したところ、カルモジュリンキナーゼ阻害剤が抽出されて来た。この結果は、カルモジュリンキナーゼ阻害剤が、BAP1欠失胸膜中皮種に対する有望な阻害剤の候補であることを示唆している。
免疫組織：cDNAマイクロアレイ網羅的発現解析とリアルタイムPCR解析によって、BAP1ノックアウト株で高発現する遺伝子としてCAMK2Dを同定し、抗CAMK2D抗体を用いた組織アレイ解析では、中皮腫50検体中で28検体(56%)が陽性を示し、CAMK2Dが診断バイオマーカーのための有望な候補であることを示すことができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

cDNAマイクロアレイ網羅的発現解析とリアルタイムPCR解析によって、BAP1ノックアウト細胞株で高発現する遺伝子としてカルモジュリンキナーゼCAMK2Dを同定し、抗CAMK2D抗体を用いた組織アレイ解析では、中皮腫50検体中で28検体(56%)が陽性を示し、CAMK2Dが診断バイオマーカーのための有望な候補であることを示すことができた。
さらに、BAP1ノックアウト細胞株を用いて400個小分子化合物ライブラリーのスクリーニングを行い、カルモジュリンキナーゼ阻害剤KN-92が特異的な細胞増殖抑制効果を示すことを見出すことができた。KN-92は、悪性胸膜中皮腫に対する分子標的薬の有望な候補になると考えられた。
以上より、本研究課題はおおむね順調に進展していると自己評価した。

Strategy for Future Research Activity

今回発見したカルモジュリンキナーゼ阻害剤KN-92による細胞増殖抑制効果の分子基盤を明らかにしていく。また、他のカルモジュリンキナーゼ阻害剤でも効果を検討する。今後さらに、新たな腫瘍特異的な細胞増殖抑制効果を示す化合物を探索するため、東京大学の創薬機構に所蔵される小分子化合物ライブリーの取得を申請し、約1～2万種類の化合物からシーズ探索を計画する。
新たな腫瘍特異的な細胞増殖抑制効果を示す化合物を探索するため、東京大学の創薬機構に所蔵される小分子化合物ライブリーの取得を申請し、約1～2万種類の化合物からシーズ探索を計画している。
本年度、抗CAMK2D抗体を用いた組織アレイ解析では、中皮腫50検体中で28検体(56%)が陽性を示し、CAMK2Dが診断バイオマーカーのための有望な候補であることを示すことができた。そこで、愛知県がんセンター、近畿医科大学、兵庫医科大学の研究チームと連携し、中皮腫患者検体を用いた抗CAMK2D抗体による免疫組織染色の規模を拡大して実施する。中皮腫特異的な染色が確認できれば、次に患者血清や胸水を用いたELISA法及びCLEIA 法を確立し、新たな早期診断の開発を目指す。
中皮腫の病態を細胞レベルから個体レベルで解析するため、樹立した細胞株を種々の免疫不全マウスに移植し、マウス造腫瘍能について検討する。癌抑制遺伝子BAP1ノックアウト株の移植に成功すれば、細胞レベルで確認された生物学的特性を個体レベルで検証することが可能となる。また、細胞レベルでスクリーニングされた化合物の効果を個体レベルで検討することも可能となる。

Causes of Carryover

本年度、抗CAMK2D抗体を用いた組織アレイ解析では、中皮腫50検体中で28検体(56%)が陽性を示し、CAMK2Dが診断バイオマーカーのための有望な候補であることを示すことができた。そこで、愛知県がんセンター、近畿医科大学、兵庫医科大学の研究チームと連携し、中皮腫患者検体を用いた抗CAMK2D抗体による免疫組織染色の規模を拡大して実施する。中皮腫特異的な染色が確認できれば、次に患者血清や胸水を用いたELISA法及びCLEIA 法を確立し、新たな早期診断の開発を目指す。

Research Products

• [Journal Article] ARK5 enhances cell survival associated with mitochondrial morphological dynamics from fusion to fission in human multiple myeloma cells. (2024)
  • Author(s): Karnan S, Hanamura I, Ota A, Vu LQ, Uchino K, Horio T, Murakami S, Mizuno S, Rahman ML, Wahiduzzaman M, Hasan MN, Biswas M, Hyodo T, Ito H, Suzuki A, Konishi H, Tsuzuki S, Hosokawa Y, Takami A.
  • Journal Title: Cell Death Discov. Volume: 10(1):56. Pages: 56
  • DOI: 10.1038/s41420-024-01814-w.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Leucine zipper protein 1 (LUZP1) regulates the constriction velocity of the contractile ring during cytokinesis. (2024)
  • Author(s): Hyodo T, Asano-Inami E, Ito S, Sugiyama M, Nawa A, Rahman ML, Hasan MN, Mihara Y, Lam VQ, Karnan S, Ota A, Tsuzuki S, Hamaguchi M, Hosokawa Y, Konishi H.
  • Journal Title: FEBS J. Volume: 291(5) Pages: 927-944
  • DOI: 10.1111/febs.17017.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PDZ-binding kinase inhibitor OTS514 suppresses the proliferation of oral squamous carcinoma cells. (2023)
  • Author(s): Kato M, Ota A, Ono T, Karnan S, Hyodo T, Rahman ML, Hasan MN, Onda M, Kondo S, Ito K, Furuhashi A, Hayashi T, Konishi H, Tsuzuki S, Hosokawa Y, Kazaoka Y.
  • Journal Title: Oral Dis. Volume: 30(2) Pages: 223-234
  • DOI: 10.1111/odi.14533.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] CAMK2D: a novel molecular target for BAP1-deficient malignant mesothelioma. (2023)
  • Author(s): Karnan S, Ota A, Murakami H, Rahman ML, Wahiduzzaman M, Hasan MN, Vu LQ, Hanamura I, Inoko A, Riku M, Ito H, Kaneko Y, Hyodo T, Konish Hi, Tsuzuki S, Hosokawa Y.
  • Journal Title: Cell Death Discov. Volume: 9(1):257 Pages: 257
  • DOI: 10.1038/s41420-023-01552-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inhibition of VEGFR2 and EGFR signaling cooperatively suppresses the proliferation of oral squamous cell carcinoma. (2023)
  • Author(s): Onda M, Ota A, Ito K, Ono T, Karnan S, Kato M, Kondo S, Furuhashi A, Hayashi T, Hosokawa Y, Kazaoka Y.
  • Journal Title: Cancer Med. Volume: 12(15) Pages: 16416-16430
  • DOI: 10.1002/cam4.6282.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Flow cytometry-based quantification of genome editing efficiency in human cell lines using the L1CAM gene. (2023)
  • Author(s): Hasan MN, Hyodo T, Biswas M, Rahman ML, Mihara Y, Karnan S, Ota A, Tsuzuki S, Hosokawa Y, Konishi H.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 18(11) Pages: e0294146
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0294146. eCollection
  • Peer Reviewed