2022 Fiscal Year Research-status Report
肺構成細胞特異的な脂質メディエーター分解促進による抗線維化機構の解明
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22K08295
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
岡本 安雄 川崎医科大学, 医学部, 教授 (80293877)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹之内 康広 川崎医科大学, 医学部, 講師 (30582233)
坪井 一人 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (80346642)
北風 圭介 川崎医科大学, 医学部, 助教 (80840545)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 線維化 / 脂質メディエーター / 脂質メディエーター分解酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「線維化肺では、スフィンゴシン1-リン酸（S1P）とリゾホスファチジン酸（LPA）の分解酵素脂質リン酸ホスファターゼ3（LPP3）の発現低下がS1PとLPAの蓄積を引き起こし、線維化を促進する。」という仮説を検証するために、組織特異的にLPP3を高発現するマウスおよび組換えアデノ随伴ウイルスゼロタイプ6（AAV6）.2FFの作製を行った。Rosa26遺伝子座にCAGプロモーター制御下で、Cre組換え酵素によりloxP配列に挟まれた発現阻止配列を除去するとLPP3を高発現するように遺伝子操作したLPP3ノックイン（LPP3-KI）マウスを2021年度に作製したが、Creマウスと交配後、Cre-loxPシステムによるLPP3の発現が認められなかった。用いた条件付きLPP3発現フラグメントから発現阻止配列内の不必要と考えられる箇所を削除し、約3 kbの条件付きLPP3発現フラグメントを作製した。2022年度文部科学省新学術領域先端モデル動物支援プラットフォーム・モデル動物作製支援を受け、CRISPR/Cas9を用いたノックイン技術を用いてマウスを作出した。計17匹が生まれ、生存した11匹のマウスの尾からゲノムDNAを抽出し、雄マウス1匹のみが挿入部位のN末およびC末のアウトサイドプライマーを用いたPCRで予想されるバンドが増幅されたことから、このマウスを候補マウスとした。また、作出された候補マウスとBL/6マウスを交配し、得られたLPP3-KIマウスから胎仔線維芽細胞を単離し、Cre組み換え酵素を導入することによりCre-loxPシステムによる発現阻止配列の除去の確認およびLPP3タンパク発現を確認した。肺に指向性の高いアデノ随伴ウイルスゼロタイプ6（AAV6）を用いた肺でLPP3を高発現するマウスを作製するために、肺でLPP3を高発現するAAV6.2FFを作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Rosa26遺伝子座にCAGプロモーター制御下で、Cre組換え酵素によりloxP配列に挟まれた発現阻止配列を除去するとLPP3を高発現するように遺伝子操作したLPP3ノックインマウスを2021年度に作製したが、Creマウスと交配後、細胞特異的なLPP3の発現が認められなかったため、2022年度にドナーベクターの再構築を行い、上記のマウスを再度作製したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度に作製した細胞特異的にLPP3を高発現するマウスあるいは経気管的に組換えAAV6.2FFを投与したマウスを用いて、LPP3遺伝子発現を促進する方法が肺線維症に有効な治療法となるか否かを明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
Rosa26遺伝子座にCAGプロモーター制御下で、Cre組換え酵素によりloxP配列に挟まれた発現阻止配列を除去するとLPP3を高発現するように遺伝子操作したLPP3ノックインマウスを2021年度に作製したが、Creマウスと交配後、細胞特異的なLPP3の発現が認められなかったため、2022年度にドナーベクターの再構築を行い、上記のマウスを再度作製した。しかし、解析まで行っていないため、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、作製したマウスの細胞特異的なLPP3のタンパク発現解析（ウエスタンブロット、免疫組織染色）に使用予定である。
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| Remarks |
川崎医科大学薬理学教室H.P.（https://kms-pharmacol.wixsite.com/website）
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[Presentation] Acid ceramidase as a third N-acylethanolamine hydrolase in cells and tissues2022
Author(s)
Kazuhito Tsuboi, Tatsuya Tai, Ryouhei Yamashita, Hanif Ali, Takashi Watanabe, Toru Uyama, Yoko Okamoto, Keisuke Kitakaze, Yasuhiro Takenouchi, Iffat Ara Sonia Rahman, Hitoshi Houchi, Tamotsu Tanaka, Akira Tokumura, Junko Matsuda, Yasuo Okamoto, Natsuo Ueda
Organizer
32nd Annual International Cannabinoid Research Society Symposium on the Cannabinoids
Int'l Joint Research
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