フィブロネクチン(FN)腎症患者に認めた変異FNの糸球体内沈着機序と治療法の開発

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08335
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 竹田 徹朗 獨協医科大学, 医学部, 教授 (10361924)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 阿部 利弘 獨協医科大学, 医学部, 助教 (90833377) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: 遺伝性腎疾患 / 糸球体沈着 / フィブロネクチン

Outline of Annual Research Achievements

本研究では変異フィブロネクチン(FN)がいかにして糸球体内に沈着するのかを明らかにすることである。
①私たちが診断したFN腎症3例のうち若年発症例の変異転写産物シークエンスを確認する。
患者末梢血白血球からRNAを抽出し、PCRおよび直接シークエンス法を用いてFN1転写産物のシークエンス解析を行うことを画策したが、PCRでFN1転写産物の検出を試みたが、発現が確認できなかった。尿中落下細胞を用いてRNAを抽出したが、RNA収量が極めて少なく、同様のPCRでFN1転写産物の検出を行ったが、条件設定を行うほどのPCRが行えず、プライマーを変更することにした。

②FN1全長cDNAを業者から購入し、鋳型として、変異を導入した。シークエンスにて確認後、発現ベクターに組み替えを行う予定である。
日本腎臓学会など関連学会でのフィブロネクチン腎症や糸球体へのフィブロネクチン沈着に関する情報交換を対面あるいはオンラインで行った。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

末梢血白血球からFN1転写産物の検出が困難であり、尿中落下細胞からのRNA抽出が収量不足か、尿に存在するRNaseの混入をいかに少なくするか意外な点で時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

変異導入はできたが、宿主培養細胞にも自身のファイブロネクチンを産生するため、培養細胞自体のFN1をCRISPR-Cas9で遺伝子編集した方が解析が進む可能性もあり、方針転換の予定である。

Causes of Carryover

期待した実験結果が得られずに、その先の発現実験に進めていないため、培養細胞や発現実験に関わる経費が計上できていない。CRISPR-Cas9の導入にて変異蛋白の解析を進めるよう方針転換し、次年度使用はその費用にあてる。