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2023 Fiscal Year Research-status Report

The structure and production pathway of skin barrier lipid protein-bound ceramide

Research Project

Project/Area Number 22K08372
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

大野 祐介  北海道大学, 薬学研究院, 助教 (50611498)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Keywordsセラミド / 結合型セラミド / 皮膚バリア / 質量分析
Outline of Annual Research Achievements

前年度に野生型マウスの表皮を用いた解析においてシステイン結合型エステル化ω水酸化セラミドと予想される分子イオンが検出されたが,この分子イオンは結合型セラミドを産生できないマウスであるCyp4f39ノックアウトマウスの表皮では消失していた。このことから,検出された分子イオンがシステイン結合型エステル化ω水酸化セラミドであることが証明された。
NMR解析により,エポキシエノンセラミドの構造を模した合成アナログがエノン部分のβ炭素を介してシステインのSH基とチオエステル結合することで結合体が形成されることを明らかにした。
合成アナログと求核性側鎖をもつアミノ酸(システイン,セリン,ヒスチジン,アルギニン,リシン)との結合アッセイを行なったところ,システイン以外のアミノ酸はいずれも合成アナログと結合しないことが明らかとなった。
角質層は顆粒層との境界面は中性であり,外側へ向かうにつれ酸性になることから,システインとエポキシエノンセラミドとの結合のpH依存性を調べたところ,結合体形成はpH6またはpH7.4では同程度であり,pH4およびpH5では低下することを見出した。このことから,結合型セラミド産生は角質層と顆粒層との境界面で行われることが示唆された。
システインとの結合に重要な官能基を明らかにするため,構造類似体(エポキシエノール,化学合成;ジヒドロキシエノン,エポキシドヒドロラーゼを用いて作製;エノン化合物,市販品)とシステインとの結合性を調べた。その結果,エノン構造をもつ化合物のみがシステインと結合することを見出した。このことから,エポキシエノンセラミドとシステインの構造にはエノン構造が必須であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

これまで存在が不明であった結合型セラミドであるシステイン結合型エステル化ω水酸化セラミドが実際にマウス表皮に存在することに加え,その構造決定,反応の特徴,特異性を明らかにすることができ,論文(iScience誌)の発表にまで至ることができたため。

Strategy for Future Research Activity

従来型の結合型セラミドであるグルタミン酸結合型ω水酸化セラミドは野生型マウスの表皮からは検出されなかったが,今回同定したシステイン結合型エステル化ω水酸化セラミドとは異なるアルカリ感受性の結合型セラミドの存在を示唆するデータが得られていることから,LC-MS/MS解析によりその存在を明らかにし,構造解析を行う。
TGM1 およびSDR9C7の結合型セラミドの産生への寄与度を調べ,結合型セラミドの産生経路を明らかにする。それぞれの遺伝子を単独および二重欠損させたケラチノサイトを作製し,分化誘導後の結合型セラミド量,および中間代謝物量をLC-MS/MS により調べる。
結合型セラミドの標的タンパク質を同定するため,合成アナログを用いた実験を行う。マウス表皮または分化ヒトケラチノサイトより調製した細胞総抽出液と合成アナログを混合し,合成アナログとタンパク質を結合させる。合成アナログと結合したタンパク質のみを精製し,トリプシン処理後,プロテオミクス解析を行う。

  • Research Products

    (4 results)

All 2023

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] Determining the structure of protein-bound ceramides, essential lipids for skin barrier function2023

    • Author(s)
      Ohno Yusuke, Nakamura Tetsuya, Iwasaki Takafumi, Katsuyama Akira, Ichikawa Satoshi, Kihara Akio
    • Journal Title

      iScience

      Volume: 26 Pages: 108248~108248

    • DOI

      10.1016/j.isci.2023.108248

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 皮膚バリア形成に重要な結合型セラミドの構造決定2023

    • Author(s)
      大野祐介、中村哲也、岩崎貴文、勝山彬、市川聡、木原章雄
    • Organizer
      第16回セラミド研究会学術集、第17回スフィンゴテラピィ研究会合同年会
  • [Presentation] 角質層の遊離セラミド組成と皮膚の乾燥・外観指標との相関解析2023

    • Author(s)
      高橋夏海、秋山史成、上田悠人、多田静乃、竹内伸之、大野祐介、木原章雄
    • Organizer
      第16回セラミド研究会学術集会、第17回スフィンゴテラピィ研究会合同年会
  • [Presentation] 表皮結合型セラミドの構造決定:マイケル付加反応により産生されるシステイン結合型セラミド2023

    • Author(s)
      大野祐介、中村哲也、勝山彬、市川聡、木原章雄
    • Organizer
      第65回日本脂質生化学会

URL: 

Published: 2024-12-25  

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