Analysis of mechanisms for atopic dermatitis-like phenotype resulting from SREBF1 gene mutations

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08432
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 下村 尚子 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (50625423)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 下村 裕 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (70397107)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: SREBF1 / SREBP-1 / アトピー性皮膚炎 / 連珠毛

Outline of Annual Research Achievements

2023年度は、2022年度に作製した野生型および変異型（p.Arg527Hisおよびp.Arg527Cys）のSREBP-1発現ベクターを用いて、培養細胞での過剰発現系で発現・機能解析を行った。まず、SREBP-1のターゲット遺伝子として最もよく知られているLDLRのプロモーター領域を、健常人のゲノムDNAを用いてPCR法で増幅し、pGL4.12-Lucベクターに組み込んだ（pGL4.12-LDLR-Promoter）。その後、SREBP-1の発現ベクターとpGL4.12-LDLR-Promoterベクターを培養細胞に過剰発現させ、24時間後に細胞培養液を回収してルシフェラーゼアッセイを実施した。しかしながら、当初の条件では野生型SREBP-1でさえもルシフェラーゼ活性を上昇させなかった。そこで、過去の文献を参考にして、培養液にmevastatinとsodium mevalonateを添加し、さらにsterolを除去する目的で無血清培地でのトランスフェクションを行った。すると、野生型SREBP-1は顕著にルシフェラーゼ活性の上昇を示した一方で、p.Arg527Hisおよびp.Arg527Cys変異型SREBP-1は全くルシフェラーゼ活性を上昇させなかった。すなわち、少なくともターゲット遺伝子の活性化に関する検討においては、解析した2種類の変異型SREBP-1は完全な機能喪失型であることが証明された。続いて、プロモーターアッセイの時と同様の条件で野生型または変異型SREBP-1を過剰発現させ、24時間後に細胞質分画と核分画をそれぞれ抽出し、western blot法で発現を解析した。野生型蛋白のみがp.527Arg付近で切断されて核内に移行すると予想されたが、意外なことに野生型と2種類のすべてでmature formと思われるバンドが検出された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

プロモーターアッセイの成功により、ようやく野生型と変異型の機能的な差異が確認できた点では進捗が認められるが、培養細胞レベルでの解析の条件設定が極めて難しく、in vivoレベルでの解析をまだ行うことができておらず、全体としては進捗がやや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

2024年度は、さらに培養条件を工夫し、野生型と変異型SREBP-1の細胞内での発現パターンにどのような違いがあるかを明らかにする。また、抗SREBP-1抗体を用いて患者および健常人皮膚でのSREBP-1の発現解析を詳細に行い、特に表皮と毛髪において同蛋白が核内に発現しているかどうかを明らかにする。