2022 Fiscal Year Research-status Report

PNHクローンの起源と変遷

Research Project

Project/Area Number	22K08452
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	高森弘之東京大学, 医科学研究所, 特任研究員 (80792077)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	南谷泰仁東京大学, 医科学研究所, 教授 (60451811) 保仙直毅大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (10456923) 西村純一大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教授 (80464246) 植田康敬大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (30533848) 藤岡龍哉関西医科大学, 医学部, 准教授 (70403045) 松岡由和関西医科大学, 医学部, 助教 (70533420)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	発作性夜間ヘモグロビン尿症 / PNH / 血液疾患 / 全ゲノム解析 / 遺伝学的系統樹解析 / 系統樹
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）患者から得た単細胞レベルの全ゲノムシークエンスデータを用いて遺伝学的系統樹解析を行い、PNHクローンの発生から臨床的なPNH発症に至る過程を明らかにすることを目的としている。本年度は、大阪大学大学院医学系研究科血液・腫瘍内科に通院中の2名のPNH患者の骨髄検体を用いて研究を行った。1名は、PIGA遺伝子変異に加えてHMGA2遺伝子変異を認める症例であり、もう1名は複数の異なるPIGA遺伝子変異が認められた症例である。患者から採取した骨髄細胞を単核球に分離し、フローサイトメトリーを用いて、造血幹細胞レベルの細胞集団をPNH分画（CD55/59陰性）とnon-PNH分画（CD55/59陽性）に分けた。次に、メチルセルロースを培地として、TPO、SCF、IL3などのサイトカインを用いてコロニー形成細胞アッセイで細胞増殖を行った。形成されたコロニーから、カラム法を用いてDNAを抽出した。それぞれのコロニーが隣接するコロニーとのコンタミネーションがない場合、単細胞を由来とする細胞集団と考えられるため、コロニーから得られたDNAも単細胞由来であるとして研究を行うことが可能である。DNAのクオリティーチェックを行い、次世代シークエンサーによる全ゲノム解析が可能なものを選択し、ライブラリー作成を行った。その後、次世代シークエンサーを用いて全ゲノム解析を実施し、全ゲノムシーケンスデータを取得した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 患者の骨髄細胞を用いて、コロニー形成細胞アッセイを行い、コロニーからDNAを抽出することができた。研究計画書の計画通りに進展していると考える。
Strategy for Future Research Activity	今後は、単細胞由来コロニーから得られた全ゲノムシークエンスデータを用いて、それぞれの患者の遺伝学的系統樹解析を行う。確認された体細胞遺伝子変異から系統樹の樹形を推定し、体細胞遺伝子変異を系統樹に割り付ける。血液細胞に生じる一塩基置換数は、経過した時間に相関することが報告されている。この原理を利用して、任意の遺伝子変異が生じた時期を推定することができる。また得られた系統樹から、合祖理論をもとに、有効細胞集団数の経過を推定することを試みる。臨床情報と統合することで、PNHクローンの誕生から疾患発症までのPNHクローンの拡大の軌跡を明らかにする。
Causes of Carryover	今回の系統樹解析では、正確な系統樹を作成するために必要なコロニーの数は不明である。今年度は、予算内でコロニー形成細胞アッセイを実施できた。得られた系統樹によっては、さらなるコロニーが必要になることがあり、その際に使用する予定である。