2023 Fiscal Year Research-status Report
Development of humanized pigs with human hematopoiesis and immune system
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22K08515
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
李 ヨキン 日本大学, 医学部, 准教授 (30599048)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三角 浩司 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (00442682)
野地 智法 東北大学, 農学研究科, 教授 (10708001)
大西 彰 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (30414890)
板野 理 国際医療福祉大学, 医学部, 主任教授 (90265827)
淵本 大一郎 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, グループ長補佐 (10343998)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 大動物実験 / ヒト化動物 / 造血幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2ヶ月齢の雌IL2rgヘテロノックアウトブタの農研機構から医学部に搬入し飼育した。8ヶ月齢から毎日外陰部から発情状況を観察し、初めての発情を確認した後、2回目また3回目の発情期に合わせて野生型ブタの精子を用い、連続3日から5日間人工授精を実施した。人工授精後約30日で超音波を用いて妊娠の有無を確認し、妊娠6週齢に深麻酔下で開腹し、子宮の上から超音波を用いて胎児を観察しながら、すべての胎児の肝臓に解凍した3x10^5/100ul/頭のヒト臍帯血細胞を注入した。誕生した仔ブタの遺伝子型を確認後、免疫不全ブタ群（IL2rg欠損仔ブタ）と野生型ブタ群に分け、経時的に血液を採取した。解剖の際には、血液、骨髄、肝臓、脾臓、回腸末端、胸腺、リンパ節などの組織を採取し、フローサイトメトリーを用いてヒト由来細胞を検出した。さらに、各内臓を固定し、免疫染色を用いてヒト由来細胞の分布などを観察した。
FACSの解析では、末梢血と骨髄細胞においてヒト由来細胞の割合は多く見られなかった。一方、1ヶ月齢の脾臓にはヒト由来細胞のキメラ率が高く見られたものの、2ヶ月齢になるとキメラ率が減少した。2ヶ月齢の免疫不全ブタの胸腺においてヒト由来細胞のキメラ率は高く、特にCD45 +細胞の約36%はヒト由来細胞であることが判明した。組織学的には、特に肝臓、脾臓、肺臓において、ヒト由来細胞はリンパ濾胞のようなクラスター形成していることが観察された。また胸腺組織には数多くのヒト由来細胞が散在し、またクラスターとして生着・増殖していることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度、研究分担者から譲り受けた2から3ヶ月齢のIL2rgヘテロノックアウトメスブタを当施設で飼育した。生殖器の変化、食欲の変化などの発情兆候が確認されると、野生型ブタの精子を用いて3から5日間の期間にわたり連続して人工授精を施行した。その後、超音波検査により30日目にすべてのブタの妊娠が確認された。妊娠6週目には、麻酔を導入後に開腹し、子宮の上から超音波検査で観察しながら、すべての胎児の肝臓へヒト臍帯血単核細胞を移植する処置を実施した。この一連の手術と臍帯血細胞の準備はすべて順調に進み、成功を収めた。また、1頭の雌ブタは妊娠116日に至っても分娩兆候が見られなかったため、プラネート（PGF2αの類縁体）2mlを連続2日間にわたって筋肉内注射し、その後無事に分娩が行われた。分娩後、生まれた仔豚の遺伝子型判定で免疫不全仔豚が確認された。これらの仔豚に対し経時的に血液採取を行い、また解剖の際、骨髄や内臓などを採取し、FACSおよび組織学的な解析を実施した。この一連のブタの飼育、人工授精、妊娠検定、細胞の準備、細胞移植手術、そして出産までのプロセスは計画通りに進行し、全体的に概ね順調に進捗していた。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度にヒト臍帯血単核細胞（3x10^5/頭、ヒト臍帯血単核細胞移植群）、または臍帯血単核細胞から分離したCD34陽性細胞（3x10^5/頭、ヒトCD34陽性細胞移植群）を用いて胎児の肝臓に移植した。わずか600個（推定）の造血幹細胞を含むヒト臍帯血単核細胞移植群は、免疫不全ブタの免疫組織においてヒト由来細胞の定着と増殖著しく、高いキメラ率が観察された。この結果は、多様なストローマ細胞を含む臍帯単核細胞を移植したほうが単離したCD34陽性細胞を移植するよりも効率的にキメラ率を高める可能性があることを示唆している。しかし、CD34陽性細胞移植群の実験頭数が少なく決定的な結論には至っていないため、引き続き実験を続ける予定である。
さらに、造血幹細胞の少ないヒト臍帯血単核細胞移植によって高いキメラ率が得られたにも関わらず、そのメカニズムやヒト由来細胞の増殖と分化についてより詳細な解析が必要である。特に、仔豚の胸腺とリンパ節に多数のヒト由来細胞が検出されたことから、免疫組織におけるヒト由来細胞の分布、分化、そして機能の解析が重要である。
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| Causes of Carryover |
分担者の研究においては、実験で使用する試薬の輸入は滞っていて、希望した試薬は入手できなかったため残額が生じた。次年度は試薬と用品購入に使用する。
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