2022 Fiscal Year Research-status Report
血小板におけるRhoA-フォルミンを介した新規脂質シグナル調節機構の解明
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22K08518
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| Research Institution | National Center for Geriatrics and Gerontology |
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Principal Investigator |
勝見 章 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 病院, 部長 (80378025)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田村 彰吾 北海道大学, 保健科学研究院, 准教授 (60722626)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | LOX / Rho family / 血小板 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血栓形成において血小板の粘着・顆粒からの内容物分泌・血小板凝集は不可欠なプロセスである。トロンビン、ADP、トロンボキサンA2(TXA2)等のアゴニスト受容体からの複数のシグナル伝達経路はGα13を介してRhoAを活性化する。その結果①血小板の形態変化②濃染顆粒内容物の分泌をおこす。血小板は止血血栓にとどまらず，動脈硬化・血管新生・炎症・アレルギー・がん転移等を含む種々の病態に関与している。この多機能性は血小板が数多くの生理活性物質を貯蔵・産生し，活性化に伴って細胞外へ放出することと関連している。血小板細胞膜から遊離したアラキドン酸は、プロスタグランジン(PG)、ロイコトリエン(LT)等の生理活性物質に代謝される。PG、TXA2を生成するシクロオキシゲナーゼ(COX)とともに、血小板にはアラキドン酸を基質とするもう１つの酵素、リポキシゲナーゼ(LOX)が存在する。LOXには酸素付加部位の違いによって5-LOX、12-LOX、15-LOXが知られている。本研究ではRhoA-フォルミンが12-LOXの細胞膜への局在を介して血小板凝集に関与する可能性につき検討する。我々はRho GTPaseをbaitとしたアフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー（LC/MS-MS）実験系を確立した。血小板細胞質分画をアフィニティーカラム精製することで、既知のエフェクター (mDia, PKN1, Rho kinase, IQGAP2, Daam1, Daam2)に加えて、アラキドン酸リポキシゲナーゼ(ALOX)が活性型RhoAに結合することが見いだされた。今年度は巨核球細胞株MEG-O1に活性型と不活性型RhoAを発現し、培養上清中の12-HETEを測定する実験系を確立し、RhoA活性の12-LOX機能への影響を調査中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々はRho GTPaseをbaitとしたアフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー（LC/MS-MS）実験系を確立した。血小板細胞質分画をアフィニティーカラム精製することで、既知のエフェクター (mDia, PKN1, Rho kinase, IQGAP2, Daam1, Daam2)に加えて、アラキドン酸リポキシゲナーゼ(ALOX)が活性型RhoAに結合することが見いだされた。以上のことから研究課題はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々はGTP結合型の活性型Rho family蛋白の一部にALOXが結合することを明らかにしており、さらにRhoA以外の複数の活性化Rho GTPasesとALOX family（5-LOX, 12-LOX, 15-LOX)の結合の有無を検討する。次にGTP結合型Rho familyとALOXをCOS7細胞で共発現し、両者の直接結合を証明する。直接結合が認められない場合は既知のエフェクターを介した結合を証明する。また相互の結合に必要なドメインの同定を行う。GTPaseの阻害薬によるALOX下流脂質メディエーターの抑制効果の証明 ALOXとの活性化依存性の結合が明らかになったRho family分子につきそれぞれの阻害剤(ボツリヌス毒素、RhoA 下流阻害剤Y-27632, Rac阻害剤NSC23766, Cdc42阻害剤ZCL278など)を内因性のALOXが発現した細胞に添加し、脂質メディエーター(ロイコトリエン、リポキシン、HETEなど)の定量を行う。
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| Causes of Carryover |
（理由）
当該年度において、アフィニティクロマトグラフィー、シグナル伝達実験はすべて所属機関に設置されている機器によりデータを得ることができ、経費の削減ができたため。
（使用計画）
令和５年度は国立長寿医療研究センターにおいて巨核球細胞株を用いたRhoA強制発現、また阻害薬による細胞生物学的研究、アクチン重合アッセイ、RhoA欠失マウスから分離した血小板を用いた実験のために予算執行をしていく。
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[Journal Article] The usefulness of tranexamic acid for bleeding symptoms of chronic consumptive coagulopathy complicated by aortic disease: a single-institute, retrospective study of 14 patients2023
Author(s)
Suzuki N, Suzuki N, Kawaguchi Y, Okamoto S, Kanematsu T, Katsumi A, Suzuki A, Tamura S, Kojima T, Kiyoi H, Matsushita T.
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Journal Title
Thromb J
Volume: 21
Pages: 10
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] VWF-Gly2752Ser, a novel non-cysteine substitution variant in the CK domain, exhibits severe secretory impairment by hampering C-terminal dimer formation2022
Author(s)
Okamoto S, Tamura S, Sanda N, Odaira K, Hayakawa Y, Mukaide M, Suzuki A, Kanematsu T, Hayakawa F, Katsumi A, Kiyoi H, Kojima T, Matsushita T, Suzuki N.
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Journal Title
J Thromb Haemost
Volume: 20
Pages: 1784-1796
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] F9 mRNA splicing aberration due to a deep Intronic structural variation in a patient with moderate hemophilia B2022
Author(s)
Odaira K, Kawashima F, Tamura S, Suzuki N, Tokoro M, Hayakawa Y, Suzuki A, Kanematsu T, Okamoto S, Takagi A, Katsumi A, Matsushita T, Shima M, Nogami K, Kojima T, Hayakawa F.
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Journal Title
Thromb Res
Volume: 213
Pages: 91-96
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Periosteum-derived podoplanin-expressing stromal cells regulate nascent vascularization during epiphyseal marrow development2022
Author(s)
Tamura S, Mukaide M, Katsuragi Y, Fujii W, Odaira K, Suzuki N, Tsukiji N, Okamoto S, Suzuki A, Kanematsu T, Katsumi A, Takagi A, Ikeda K, Ueyama J, Hirayama M, Suzuki-Inoue K, Matsushita T, Kojima T, Hayakawa F.
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Journal Title
J Biol Chem
Volume: 298
Pages: 101833
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Protein S-Leu17Pro disrupts the hydrophobicity of its signal peptide causing a proteasome-dependent degradation2022
Author(s)
Okada K, Tamura S, Suzuki N, Odaira K, Mukaide M, Fujii W, Katsuragi Y, Suzuki A, Kanematsu T, Okamoto S, Suzuki N, Katsumi A, Matsushita T, Kojima T, Hayakawa F.
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Journal Title
Thromb Res
Volume: 210
Pages: 26-32
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Development and validation of a novel qualitative test for plasma fibrinogen utilizing clot waveform analysis2022
Author(s)
Suzuki A, Suzuki N, Kanematsu T, Shinohara S, Kurono H, Arai N, Okamoto S, Suzuki N, Tamura S, Kikuchi R, Katsumi A, Kojima T, Matsushita T.
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Journal Title
Sci Rep
Volume: 12
Pages: 434
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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