2023 Fiscal Year Research-status Report
間葉系組織からの骨芽細胞分化に着目した強皮症石灰沈着症の機序解明と治療標的探索
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22K08554
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Research Institution | Nippon Medical School |
Principal Investigator |
白井 悠一郎 日本医科大学, 医学部, 講師 (70528801)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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Keywords | 強皮症 / 石灰沈着症 / 骨芽細胞 |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、全身性強皮症における異所性の石灰沈着症の機序解明を目的としている。今年度は、臨床現場で全身性強皮症の石灰沈着症に対する治療薬として使用されているジルチアゼム、プロベネシド、ミノサイクリン、コルヒチンの4つを用意し、間葉系幹細胞からの骨芽細胞誘導の培養系に複数の濃度を振って、石灰誘導の阻害効果を検討した。予め細胞毒性試験でviabilityを確認した上で添加濃度を検討し、前3剤は0, 1, 5 ug/mLで、コルヒチンのみ0, 0.2, 1 ng/mLとした。評価項目の一つは石灰誘導の有無は半定量的にアリザリンレッドS染色の吸光度測定とした。もう一つは、骨芽細胞のカスケードの上流であるRUNX2、およびその下流であるALP、BGLAP(osteocalcin)、type I collagen、SPP1(osteopontin)の合計5種類の遺伝子発現の量を定量的PCRで評価し、GAPDHとの比で算出した。その結果、ミノサイクリンでは、BGLAPを除いて濃度依存的な阻害効果が見られた。ジルチアゼム、プロベネシドは明らかな阻害効果は見られず、コルヒチンは細胞のviabilityがやはり低く、さらなる条件検討を要した。 また、今回は石灰沈着症を有する患者から石灰沈着が付着している組織の切除検体を1件採取した。検体摘出時、組織の断面からスタンプ標本を作製したところ、アリザリンレッドSで染色され、リン酸カルシウム成分であることを確認した。また、パラフィン標本を作製し、HE染色したところ、ヘマトキシリン陽性の結晶の近傍に、小型の単核球が集簇していることを確認した。また、この組織は摘出後直ちに培養し、石灰化を自発的に産生する細胞群の増殖をさせ、一部は培養を残し、残りの大部分は保存している。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の最終段階での解析に必要な患者由来のex vivo検体は、症例が少なく、手術を必要とするため、そのような症例の組織を得るのに時間を要している。
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Strategy for Future Research Activity |
①間葉系幹細胞を用いた培養系では、石灰化誘導(5種類の遺伝子発現、アリザリンレッドS染色で検証)に対する4種類の薬剤の条件検討を確定し、3種類の間葉系幹細胞株で最終的に検討する。②手術検体は、石灰沈着を伴う組織と伴わない組織の2群に分けて採取する。各部位からmRNAを抽出してRNA seqで遺伝子発現レベルを比較する。③手術検体から樹立した培養系を設定し、①で検討した治療薬を添加して石灰沈着が抑制できるか、またその機序を検討する。
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Causes of Carryover |
本研究で最も研究費を要するのが患者から採取した検体の解析であるが、そのような症例がまだ想定しているほど集積できていないため。
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