2023 Fiscal Year Research-status Report
ファージ吸着分子結合マイクロ粒子を利用した抗C. difficile治療法の創出
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22K08580
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
内山 淳平 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (20574619)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡辺 茂 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 教授 (70253333)
関谷 洋志 松山大学, 薬学部, 准教授 (70454890)
松井 秀仁 北里大学, 大村智記念研究所, 講師 (80503797)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | Clostridioides difficile |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ディフィシル菌（Clostridioides difficile）は、感染症の治療には抗菌薬が使用される。多くの抗菌薬に耐性であること、抗菌薬の副作用の点から、本感染症に対して抗菌薬に依存しない治療法の開発が求められている。
細菌ウイルスであるバクテリオファージ（ファージ）は細菌種特異的に感染するという特徴を有する。ファージの菌種特異的感染には、宿主菌への吸着が第一義的に重要で、ファージの尾部に存在する尾繊維やスパイクなどの吸着に関与する分子（ファージ吸着分子）と細菌表層の特異的な相互作用に起因する。ファージ吸着分子には、それ単独で菌種特異的な吸着能力を有する。
研究代表者は、世界に先駆けて、ファージ吸着分子は、抗体と同等の高い性能を有しているばかりでなく、開発コストや製造に関して優れており、細菌特異的な抗体の代替えとして利用できることを提唱した。研究代表者は、C. difficile腸炎の治療法の問題に対して、ファージ吸着分子を結合したマイクロ粒子を投与することで、腸管内でマイクロ粒子がC. difficileが特異的に凝集体を形成し、糞便として排出されることでC. difficileを除菌する方法を考案した。本治療法は、難渋化するC. difficile腸炎の問題を解決する新しい治療薬のシーズとなると考えた。
本研究課題では、４つの研究項目を実施する：（I）「C. difficileファージ吸着分子の作製」、（II）「C. difficile特異的ファージ吸着分子の結合メカニズムの解明」、（III）「ファージ吸着分子結合マイクロ粒子の作製」、（IV）「C. difficile腸炎マウスモデルに対するファージ吸着分子結合マイクロ粒子投与による評価」。本年度は、研究項目（I）を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ディフィシル菌（Clostridioides difficile）は、発頻度の高さやそれに伴う重症化、薬剤耐性菌の出現により世界的に深刻化している。現在、既存の抗菌薬に代わる新たな治療法の開発が求められている。細菌ウイルスであるバクテリオファージ（ファージ）の高い菌種特異性は、第一義的にファージ尾部先端に存在する吸着タンパク質（ファージ吸着分子）が決定する。本研究の目的は、新規ファージ吸着分子を結合させたマイクロ粒子の利用によりC. difficileをトラップすることで殺さずに、腸管からC. difficileを排出・除菌するC. difficile腸炎の新規治療法の技術基盤の創出を行うことである。
本年度は、昨年度同様にファージ吸着分子の分離を試みた。複数の分子のクローニングを行い、ファージ吸着分子を分離した。C. difficleの分離株に対する結合能を評価した。その結果、C. difficleに対する吸着性は確認されなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、昨年度見つけた吸着分子の結合に関する解析を行う。具体的には、ファージ吸着分子を臨床応用するためには、分子メカニズムを明らかにする必要がある。はじめに、各種結晶化キットを用いてファージ吸着分子の結晶化を行い、X線構造解析によりタンパク質の構造を決定する（研究協力者 香川大学 神鳥成弘）。次に、C. difficile 菌体破砕物をファージ吸着分子に結合させ、LC-MSで解析し、レセプター分子を同定する。最終的には、レセプター分子とC. difficile特異的ファージ吸着分子との共結晶を作製し、吸着メカニズムを分子レベルで解明する。
また、ファージ吸着分子結合マイクロ粒子の作製を行う。ファージ吸着分子を分散させた状態で溶液中に存在させることでマイクロ粒子に均一に結合させることができる。ファージ吸着分子の構造情報を参考に、組換えタンパク質が適切に分散する緩衝液を予測する。動的光散乱光により推定緩衝液中のファージ吸着分子の粒径測定を行い、ファージ吸着分子の分散性を検討する。高い分散性を有する緩衝液で種々のサイズのポリエスチレンマイクロ粒子へ組換えタンパク質をアミド結合させる。ファージ吸着分子結合マイクロ粒子の活性の測定は、マイクロ粒子とC. difficileと混和し、凝集性を目視で判定すると同時に低速遠心後の上精中のC. difficileの残存量を測定することにより評価する。
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| Causes of Carryover |
R4年度、候補分子の探索を行ったが良い候補分子が見つからなかった。そのため、R5年度、再度、候補分子の探索を行った。予定通りに実験が進まなかったため、予算のずれが生じた。R6年度はピッチを上げ予定通りに実験を行う。
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[Journal Article] Polyamines and linear DNA mediate bacterial threat assessment of bacteriophage infection2023
Author(s)
de Mattos CD, Faith DR, Nemudryi AA, Schmidt AK, Bublitz DC, Hammond L, Kinnersley MA, Schwartzkopf CM, Robinson AJ, Joyce A, Michaels LA, Brzozowski RS, Coluccio A, Xing DD, Uchiyama J, Jennings LK, Eswara P, Wiedenheft B, Secor PR
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences
Volume: 120
Pages: e2216430120
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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