2022 Fiscal Year Research-status Report
Induction of hypothalamic neurons by neuronal direct reporogramming
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22K08637
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
亀山 俊樹 藤田医科大学, 医学部, 准教授 (60298544)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長崎 弘 藤田医科大学, 医学部, 教授 (30420384)
田崎 加奈子 (齋藤加奈子) 藤田医科大学, 医学部, 講師 (50746906)
小谷 侑 藤田医科大学, 医学部, 講師 (60644622)
河田 美穂 藤田医科大学, 医学部, 助教 (90761601)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | SFEBq法 / 分散培養 / オルガノイド / RNA-seq / ダイレクト・リプログラミング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず、SFEBq法による視床下部神経細胞分化の際の遺伝子発現変化をRT-qPCRで詳細に解析を行った。SFEBq法により培養14日目に視床下部神経前駆細胞が生じるが、その後は、細胞を分散処理して平面培養（2Ｄ培養）条件下、またはセルカルチャー・インサート上でオルガノイド様細胞塊のまま（3Ｄ培養）培養を継続し、視床下部神経を分化・成熟させる。この際、2Ｄ培養下と3D培養下デバソプレッシン（AVP）神経の分化効率に違いがあることに着目した。そこでAVP神経以外の神経細胞についても分化効率を比較したところ、３Ｄ培養の方が高効率で分化する細胞種、反対に２Ｄ培養下の方が高効率で分化する細胞種、および２D培養でも３Ｄ培養でも分化効率は変わらない細胞種があることが明らかとなった。
このことから、2D培養と3D培養は、単純に神経分化効率に差があるばかりでなく、神経細胞の特異性を生み出す機構にも差異が生じていることが推測された。この差異を明らかにするため、培養14日目視床下部神経前駆細胞（PRE）、2D培養および３Ｄ培養でそれぞれ28日後の細胞からTotal RNAを生成しRNA-seqによりトランスクリプトーム解析を行った。その結果、Notchシグナル関連因子の他、AVP神経やオキシトシン（OXT）神経の細胞に関与することが知られているOtpやPou3f2等複数の遺伝子の発現が2D培養下と3Ｄ培養下で変化していることが明らかとなった。
一方で、視床下部神経ダイレクト・リプログラミング法の開発のため、今年度はES細胞（EB5細胞株）を用いて、視床下部神経細胞分化に必要な遺伝子群の組合せの検討を行った。その結果、ある転写因子の組合せによりAVP神経、OXT神経の分化を誘導する事に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究費には限りがありその中で確実に目標を達成させるため、当初計画に合ったscRNA-seq解析は断念せざるを得なかった。しかしながら、複数の分化条件の検討と丹念なRT-qPCRによる分化効率の比較により、2D培養と3D培養の培養条件の違いで、単純に神経分化効率に差があるばかりでなく神経細胞の特異性を生み出す機構にも差異が生じていることが推測される結果を得たことがブレークスルーとなった。実際RNA-seq解析で各培養条件でのトランスクリプトーム比較をしたところ有望な候補遺伝子を複数得ることができた。
ダイレクト・リプログラミングに向けては、VierbuchenやPangらによるBAMN因子、BAMN因子のいくつかはこれまでの研究で解析を進めていたので、これらの因子を基礎に既知のAVP神経分化関連遺伝子を組合せることで、効率的に解析を進める事ができた
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| Strategy for Future Research Activity |
トランスクリプトーム比較解析により得られた複数の候補遺伝子についてAAVベクター系を用いた強制発現実験を行うことで、SFEBq法による特異的な視床下部神経細胞の分化・成熟機構を明らかにする。さらにAVP-GFPラット、OXT-RFPラット、AVP-GFP/OXT-RFPダブルTgラット由来神経前駆細胞のクローナル培養実験、GFP/RFP陽性細胞のトランスクリプトーム解析を通じてAVP神経およびOXT神経の特異的分化を制御する因子を突き止めていきたい。
ES細胞を用いた強制発現実験で明らかとなった候補遺伝子の組合せを、線維芽細胞に強制発現することでダイレクト・リプログラミングによって視床下部神経細胞分化を誘導できるか検証していきたい。
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| Causes of Carryover |
サンプル調製の都合上、RNA-seq解析の一部を次年度に計上することとなったため。
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