2023 Fiscal Year Research-status Report
TTC7A欠損に起因する難治性腸閉鎖症のパラログ遺伝子発現促進による治療
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22K08725
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| Research Institution | Japanese Red Cross Wakayama Medical Center |
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Principal Investigator |
金井 理紗 日本赤十字社和歌山医療センター(臨床研究センター), 小児外科部, 医師 (50935947)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木下 和生 静岡社会健康医学大学院大学, 社会健康医学研究科, 教授 (50293874)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 炎症性腸疾患 / 腸閉鎖 / TTC7A / TTC7B / SW620 / LoVo |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 内在性TTC7B遺伝子のC末端にmAIDとGFPを付加するノックインの結果
SW620細胞株と、前年度作成したTTC7A欠損SW620細胞株に、TIR（auxin-inducible degron (AID)を認識して分解するタンパク）遺伝子を導入し、安定発現細胞株を樹立した。その細胞に前年度作成したTTC7BのC末端にAIDドメインを付加するためのtargeting vectorを、TTC7B遺伝子を標的としたCRISPR-Cas9とともにlipofectionで遺伝子導入した。targeting vectorの上流と下流でPCRを行い、相同組み換えが確認できた細胞が9クローン得られた（SW620細胞株由来が8クローン、TTC7A欠損SW620細胞株由来が1クローン）。しかしTTC7BのC末端にGFPを付加したこれら9クローンはGFPを発現していないことが判明し、GFPを指標にタンパクの局在と分解をモニタリングする計画は実現できないことがわかった。そのため方針を変更することとした。
2. Cre-loxPを用いたConditional knockout
次にTTC7Bのexon 8の上流と下流にloxP部位をCRISPR-Cas9で導入し、Cre組み換え酵素の一過性発現によりexon 8（64塩基対）を欠失させることを試みた。欠失によりexon skippingが起こると、フレームシフトによるTTC7Bタンパクの欠損が起こると予想された。SW620細胞株と、TTC7A欠損SW620細胞株にloxPを含むオリゴとexon 8上流をターゲットとするCRISPR-Cas9タンパクを電気穿孔法（4D-Nucleofector）により導入した。その結果、55クローン中7クローンにhomozygous挿入が確認された。今後exon 8の下流にloxPを導入する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
内在性TTC7B遺伝子のC末端にmAIDとGFPを付加するノックインを行うことでGFPを指標にタンパクの局在と分解をモニタリングする計画であったが、GFPが発現していないことが判明し、研究デザインの方針をCre-loxPを用いたConditional knockoutに変更したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cre-loxPを用いたConditional knockoutを進める。現在TTC7Bのexon 8の上流にloxP部位をCRISPR-Cas9で導入できており、今後exon 8の下流にも導入予定である。これが得られれば、Cre組み換え酵素の一過性発現によりexon 8を欠失させ、フレームシフトによるTTC7Bタンパクの欠損を起こすことができるようになる。それにより細胞死が起こる結果が得られれば、合成致死を起こすことが証明できる。また細胞死が確認されるようなら、死につつある細胞の形態をタイムラプス撮影でその様子を観察する。
また同じ細胞株に対して、TTC7Aをトランスジーンで供給すると細胞死が防がれることが証明できれば、TTC7AとTTC7Bの機能的冗長性が証明される。
また内在性のTTC7Bの増強により細胞死が確認されなければ、GIDIDにおけるTTC7A欠損を補償できる可能性を示唆し、パラログの発現増強による遺伝子治療に基礎的な概念実証を与えるものと考えられる。
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| Causes of Carryover |
本年度は研究デザインの方針変更があり、進捗が遅れているため。次の研究計画で使用予定。
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