リンチ症候群関連大腸癌の病態に寄与する三次元ゲノム構造の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08872
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 横山 雄起 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60615714)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 浩文 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30322184)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: リンチ症候群 / 大腸癌 / 三次元ゲノム構造

Outline of Annual Research Achievements

リンチ症候群関連大腸癌は全大腸癌の2-4%を占めると推定されており、散発性の大腸癌に比べて低分化腺癌や粘液癌・印環細胞癌が多いなど、特徴的な臨床像を示すが、なぜそのような特徴を有するのかについては明らかとなっていない。核内における三次元ゲノム構造が組織特異的な遺伝子発現や、分化過程における各分化段階でのlineage-specificな遺伝子発現などを厳密に制御していることが明らかとなってきており、注目を浴びている。我々は最近、三次元ゲノム構造解析技術であるin vitro engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation sequencing (in vitro enChIP-Seq) 法を用いた研究の結果、大腸癌細胞株において上皮性細胞接着分子であるEpCAM遺伝子のプロモーター領域がリンチ症候群関連遺伝子であるMSH2遺伝子と三次元的に結合していることを示唆するデータを得た。そこで本研究では、リンチ症候群関連大腸癌の病態に関与する三次元ゲノム構造について、細胞株、臨床サンプルを用いた実験によって明らかにする。本研究の結果、リンチ症候群に関する新たな知見が得られることが期待される。初年度の研究ではCRISPR/Cas9システムを応用し、guide RNA依存的に標的領域を活性化、抑制化できるCRISPRa, CRISPRi実験を行うためのプラスミドを作成し、大腸癌細胞株を用いてEpCAM遺伝子のプロモーター領域を活性化ないしは抑制化した際にMSH2遺伝子の発現にどのような影響が生じるかについて検討を行なった。その結果、EpCAM遺伝子のプロモーター領域を活性化ないしは抑制化すると、それに連動してMSH2遺伝子の発現も増加ないし低下した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画に従い、本年度はEpCAM遺伝子とMSH2遺伝子の間で形成される三次元ゲノム構造が両遺伝子の発現に対してどのような役割を果たすかについて明らかにするため、CRISPR/Cas9システムを応用し、guide RNA依存的に標的領域を活性化、抑制化できるCRISPRa, CRISPRi実験のセットアップを行い、EpCAM遺伝子プロモーターの活性化、抑制化に成功した。さらに、EpCAM遺伝子プロモーターの活性化、抑制化するとMSH2遺伝子の発現がそれに連動して上昇、低下することも明らかにすることができた。この結果は、EpCAM遺伝子とMSH2遺伝子の間で形成される三次元ゲノム構造が両遺伝子の協調的な発現調節に関わっていることを示唆している。
以上の通り、本年は計画していた研究が順調に進捗し、次年度へ向けた準備も進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

今後はEpCAM遺伝子プロモーター領域と三次元的に結合しているMSH2遺伝子を標的として、本年度同様にCRISPRa, CRISPRi実験を行い、遺伝子発現への影響について検討を行う。さらに、CRISPR/Cas9システムを用いて三次元的に結合している領域を欠失させた変異体の作成や大腸癌組織サンプルを用いたEpCAM, MSH2の免疫染色についても準備を進め、検討を行っていく。