ピロリ菌の病原性発現におけるファージエピソームの関与機構の解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08875
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 前田 広道 高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 講師 (20437734)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松崎 茂展 高知学園大学, 健康科学部, 教授 (00190439) ; 長崎 慶三 高知大学, 教育研究部自然科学系理工学部門, 教授 (00222175) ; 花崎 和弘 高知大学, 医学部附属病院, 特任教授 (30240790) ; 高橋 迪子 高知大学, 医学部, 特任助教 (40868189) ; 竹内 啓晃 国際医療福祉大学, 成田保健医療学部, 教授 (90346560)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: ピロリ菌 / ファージ

Outline of Annual Research Achievements

ピロリ菌関連疾患を理解し治療につなげることを目的として、ファージとピロリ菌病原性の関係を解明し、ピロリ菌およびファージの生態を解明することを目標に研究を継続した。研究計画に沿って、ファージエピソームの獲得・伝播様式の解析として、ピロリ菌（ピロリ菌株 3401、26695、または HPK5）に対してKHP40の吸着実験を行い、菌株間の違いや、経時的な変化など、動態を明らかにした。また、KHP40は胃内環境に近いpHにおいても維持されていることを証明した。エピソーム保有菌株を液体培地中で培養し、経時的な菌数測定とプラークアッセイをもとに、菌細胞外へのファージ自然放出頻度を算出することで潜伏期間とバーストサイズを明らかにした。一般的な細菌に感染するファージに比較して特徴的な自然放出頻度が観察された。
また、以前に報告された KHP30 エピソームとの対照的な実験として、H. pylori KMT83 由来のKHP40 エピソームに関して、クローン間の遺伝的な多様性について調査したところ、従来の知見とは異なる性質を持っていることを明らかにした。これらの知見は、ファージエピソームの生態を明らかにすると同時に、クローン間、strain間の多様性を表す重要な知見となった。また、H. pyloriが胃上皮細胞に定着すると増殖とともに、遺伝的多様性を持つ KHP40 関連ファージが放出され、放出されたファージが、未熟な他のピロリ菌株に感染し、子孫ファージを生成すること、 一方のファージ感染成熟型ピロリは、自らKHP40関連ファージを産生することが推測された。しかしながら、放出されたファージ粒子またはその DNA が胃上皮細胞と相互作用するかどうかは現時点では明らかではなく今後の課題となっている。これらの知見は現在論文化を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ファージエピソームの獲得・伝播様式の解析を終了することができた。今後、研究計画に沿って、エピソーム保持機構の検討、 細胞内エピソームが菌体の増殖能、運動性および胃への定着能に及ぼす影響の検討を行っていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

今後、エピソーム保持機構の検討を行っていく。そのために、エピソーム上の複製開始点の特定と当該部位に結合するタンパク質の特定するために、oriを含むプラスミドを抽出し、塩基配列を確認する。さらに、ファージエピソーム保持機構の解明のために、既知のファージ遺伝子に対する定量PCR系を構築していく予定である。ファージ感染後の菌体を集菌し、得られたRNAを逆転写後、定量PCRによりファージ遺伝子の発現パターンを検討する。

Causes of Carryover

本年度の研究では実験は比較的順調に進行したが、時間のかかる研究が多く、予定よりも人件費が必要となった。一方で物品の購入は予定よりも少ない状態で研究の進捗を得られた。次年度以降、研究計画に沿って、必要な物品の購入と研究の推進を行う予定である。