FFPE標本に対する超高感度微量解析のための革新的cDNA合成法の開発

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08898
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 宮尾 晋太朗 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (00833708)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 巽 孝成 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (70896711) [Withdrawn] ; 辻本 成範 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (80896712)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: FFPE / RNA-seq / DRaqL

Outline of Annual Research Achievements

マウスES培養細胞をホルマリン固定した細胞に対する定量性の高いcDNA合成法の確立
予備実験と同様に「2i+LIF」条件下で培養した, より均一性の高いES細胞集団を標準試料として使用し, 仮説として挙げた方法論の条件検討を行う. 単離したES細胞をホルマリン液に浮遊させて固定を行い, 遠心し洗浄する. 実体顕微鏡で観察下に1-10細胞程の微少量を採取し, cDNA合成を行う. また同一の細胞集団から未固定の細胞も採取し, cDNA合成を行う. 代表的な遺伝子群の発現レベルをqPCRで比較し, ホルマリン固定された細胞において生細胞に近いレベルでの合成効率
を目標とする. この行程においてはSC3-seq法に加える試薬の影響や, 温度条件によって生じる可能性のあるRNA分解に留意しつつ, cDNA合成を最適化する.
予備実験段階では24時間ホルマリン固定を行った細胞に対しては, タンパク分解酵素を加えることでcDNA合成効率は改善は認めたが, さらに精度の向上を目指し, 条件検討を追加で行う. その他より効率的に細胞溶解するために, detergentの検討やその他試薬の条件検討を行い, ES細胞のホルマリン固定という最も安定的な条件における, 手法のbrushupを行った.
その結果, 現在使用していたSC3-seq法ではない手法に対してタンパク分解酵素の行程を加えるとどうなるかを検証した.

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当大学の発生再生医学教室にてSmart-seq2をベースに高品質なRNA-seq手法であるDRaqL法が開発された. 研究者も同教室で手法の開発に携わった. この手法ではより効率的に細胞溶解が可能となり, laser capture microdissection (LCM)で単離した細胞から高品質なRNA-seqが可能となった.
本手法はFFPEサンプルの細胞溶解にも非常に有用と考え, SC3-seq法に代わるベースの手法として選択した. この手法に研究者が前年度までに検討していたProtease処理の行程を加えて詳細な条件検討を行った.
cell lineレベルの培養細胞をホルマリン固定した細胞に関しては, 今回検討した手法でホルマリン固定を行っていない細胞と遜色のないレベルで, 発現量の比較的少ない遺伝子の検出も可能であった.

Strategy for Future Research Activity

ホルマリン固定のみに対しては微量解析の方法論が確立できたと考えた. 今後はパラフィン包埋に対しての方法論の開発と条件検討を行う必要がある.
その後はFFPE標本は固定に際してのRNAのdegradationや、固定後にもRNAの経年劣化が進むことは既報として知られており, 確立した方法論が固定条件や固定後の経年に応じてどの程度の品質が担保されるかを, 臨床検体を用いて検証していく必要があると考える.