肺オルガノイド細胞療法による肺再生の基盤技術の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K08978
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 吉元 崇文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 研究協力員 (60899532)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土肥 良一郎 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (00817786) ; 土谷 智史 富山大学, 学術研究部医学系, 特命教授(教授クラス) (30437884) ; 永安 武 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (80284686) ; 松本 桂太郎 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (80404268)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 肺再生 / オルガノイド移植 / 血管化

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は第一に、血管新生の素地をもった多細胞系肺胞オルガノイドを構築することである。第二に、生体内肺血管網を再現した生体由来3次元マトリックス上において、移植オルガノイドと生体内肺血管網との連結を達成することである。第三に、マウス移植による生体内環境において多細胞オルガノイドを肺組織への定着率改善・成熟化を達成することである。将来的なオルガノイド移植の基礎技術の開発が期待できる。令和四年度は多細胞系肺胞オルガノイドの作製を開始した。マウス肺組織より単離した2型肺胞上皮細胞を用いた単一細胞集塊（スフェア）を作製しフィーダーフリー培養で継代・長期培養する技術を習得した。この構造体を基本とし、2型上皮細胞のニッチ細胞である脂肪線維芽細胞や、血管内皮幹細胞の単離と内皮細胞の細胞集塊の組み込みを行う予定とし、現在、各細胞の単離・培養へ取り組んでいる。肺胞オルガノイドの血管化技術はまだ報告がなく、重要なオルガノイド培養技術となりえる。令和五年度は、オルガノイドを播種する生体内肺血管網を再現した生体由来3次元マトリックスの作製、および同マトリックス上の血管網とオルガノイド内血管とを連結する技術の開発へ着手する予定である。また、最終的な生体内へのオルガノイド移植実験へ向けて、エラスターゼ誘導マウス肺気腫モデルの準備と、移植オルガノイド細胞を標識するための各種細胞のレポーターマウスを用いた研究を開始できるように準備をする必要がある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

脂肪線維芽細胞の同定法が複数あり、単離方法の決定と習得に時間を要している。また、血管内皮細胞の単離が難しく、かつ市販されている細胞株での代用も選択が少なく、オルガノイド血管化の障壁となっている。マウスより血管内皮細胞を単離する技術の習得に時間を要し、律速段階となっている。以上の理由により、当初の実験計画よりも実験進捗が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

今後の推進策として、研究の律速段階となっている血管内皮細胞については単離・培養技術の提供を受ける必要があり、研究協力をお願いすることも検討される。血管内皮細胞の単離・増殖の技術を獲得したのちは、計画に沿って研究を加速度的に進めていく。血管化については流体デバイスを用いたフロー刺激やVEGF濃度勾配などの刺激を加える必要があり、流体デバイス作製の技術提供を受けることも検討する必要がある。

Causes of Carryover

当初予定していた血管網構築とオルガノイドへの連結の実験の遅れに伴い物品費の執行ができなかったため。翌年度において、各種細胞の単離・培養またはオルガノイド培養の試薬、脱細胞化肺組織採取の試薬、遺伝子組み換えマウスを含めた実験動物を購入するための費用、飼育費が必要となる。また、解析の工程においては、オルガノイドの免疫染色、電子顕微鏡像の撮像、血管網の観察のために二光子顕微鏡用の試薬、脱細胞化細胞外基質の蛋白染色、マイクロアレイによる遺伝子発現解析、などに必要な試薬を購入するために計上する。さらに、研究成果の発表のための旅費や論文投稿費などに使用する予定である。