iPS細胞から誘導した気管支肺胞幹細胞～その性格とオルガノイドを用いた肺再生研究

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K09005
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 鳥羽 博明 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (40403745)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河北 直也 徳島大学, 病院, 講師 (60522266) ; 高嶋 美佳 徳島大学, 病院, 特任助教 (70596254) [Withdrawn] ; 坂本 晋一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 特任助教 (30740675)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: iPS細胞 / 気管支肺胞幹細胞 / オルガノイド / 細胞外小胞 / 肺再生

Outline of Annual Research Achievements

本研究においては，われわれが世界で初めて確立したマウスiPS細胞由来の気管支肺胞幹細胞（マウス終末細気管支に存在する局所の幹細胞：iPS-BASCs）の性格と治療への応用が可能かどうかについて検証することが目的である．
今年度やるべきことの大きな柱は，iPS-BASCsとマウス肺から採取したBASCs（primary BASCs）の性格を比較することであった．昨年度難渋した，RNAシークエンスに回すための十分な量のprimary BASCsを確保することであった．摘出したマウス肺の溶解液や濃度，温度や時間を数回変更したり，使用する一次抗体を別会社のものに変更したりなど，試行錯誤したが，やはりマウス肺から確保できるprimary BASCsの量は0.5～1%程度で，RNAシークエンスにかけることができるほどの量を得ることができなかった．今後の方向性について検討する必要があると考えている．RNAシークエンスに関しては，すでに外部委託業者の選定やその担当者との議論は済ませており，次の方向性が決まり次第，行うことができる．
もう一つのやるべきことは，ナフタレン誘導終末細気管支障害マウスモデルを作成し，iPS-BASCs由来の細胞外小胞（extracellular vesicles: EVs）投与によるパラクライン効果を検証することについて引き続き進めた．ナフタレン群(各n=4)/コントロール群(DMEM50ul, 各n=4)/iPS-BASCs群(1.0×106 cells/50ul, 各n=4)/EVs群(EVs液50ul, 各n=4)の4群に分け，B6マウスにナフタレン(200mg/kg)腹腔内投与後1日目に各群それぞれ気道内投与して終末細気管支障害モデルを再現することができた．iPS-BACSsからのEVsの確保はすることができているが，前述のprimary BASCsの実験に注力したため，EVsの投与を行うまでには至っていない．だが，モデルはすでに確立できており，今後は速やかに当初の実験を進めていくことを考えている．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

iPS-BASCsとマウス肺からのprimary BASCsを大量に確保することができていないことが最も大きな要因である．primary BASCsの大量かつ効率的な確保に関しては，プロトコールを数回見直し，マウス肺の溶解液の濃度の種類，時間や温度の変更や一次抗体の変更などを行ったが，結局改善が得られなかった．よって，ＲＮＡシークエンスに回すだけの大量のprimary BASCsを確保することは難しいと判断している．今後は方向性の転換が必要であると考えている．in vivoモデルはやや停滞したが，その要因は前述のprimary BASCsの実験に難渋したことと考えている．以上のことから，やや遅れていると評価した．

Strategy for Future Research Activity

RNAシークエンスに関しては，すでに外注委託業者の選定は終了し，担当者との協議も終了している．マウスからのprimary BASCsの十分な量を確保するために，数回のプロトコール見直しを行い試みてきたが，うまくいかなかった．そのため，今後は分化させたpurityの高いiPS-BASCsをより効率的に分化させる方法を確立することを目指すことに切り替える．そのために，分化前のマウスiPS細胞とiPS-BAScsとをRNAシークエンスで網羅的に比較し，効率的に分化を促進する遺伝子の同定を進めていく予定である．In vivoモデルに関しては，手技的には確立できており，引き続き進めていく予定である．

Causes of Carryover

予定していた外部委託のRNAシークエンスの費用のために確保していたが，次年度に実施することとなり，次年度使用額が生じたと考えている．翌年度分として請求した研究費と合わせて，主に外部委託のRNAシークエンスの検査費用ならびに結果解析に使用する予定である．