2023 Fiscal Year Research-status Report
重症敗血症病態の白血球減少に関与するmicroRNAと標的遺伝子、蛋白質の同定
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22K09084
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
竹下 淳 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (40433263)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中嶋 康文 近畿大学, 医学部, 教授 (70326239)
影山 京子 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (80347468)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | microRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
耐糖能障害を伴う（重症）敗血症では、過剰な免疫抑制状態が生じ、予後不良を来すが、我々は血球や血管内皮細胞が産生するmicroRNA（miRNA）が、炎症病態を修飾する重要な要因になると考える。その機序と新しい治療法を見出すために、次世代シーケンサーによる網羅的なmRNA、及びmiRNA発現解析、遺伝子導入手技等を用いて病態を解明し、今後の遺伝子治療を展開したい。その中で、特に好中球の炎症性細胞死に注目している。
実験を遂行するために、培養細胞実験としてヒト骨髄性白血病細胞HL-60細胞を、ジメチルスルホキシド（DMSO）にて好中球に分化し実験を行った。HL-60 培養細胞株を用いて、in vitro での分葉核の形成と NETs 類似の構造体の誘導系を確立した。糖濃度の異なる培養液を用いた好中球の培養系において、LPSを含有する培養液で24-48時間培養後、ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸塩（PMA）負荷し、好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンを蛍光色素染色後、蛍光倒立顕微鏡で観察、また培養後の回収液をフローサイトメーターで定量化し、対象群と比較検討した。さらに細胞からTotal RNAを分離し、次世代シーケンサーを用いて得た実験データを用いて、mRNA及びmiRNAの発現の網羅的解析をCLCバイオ社解析ソフト（Genomic Work Bench）を使用して行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍で、外部委託業者の出勤時間、営業時間が限られていたため、一部の実験に遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞死・炎症惹起物質に関連するmRNA、及びそれに相補配列のあるmiRNAを選別し、Real-Time PCR法で、RNA発現の絶対定量を行った。
上記の実験で上昇したmiRNAのmimic（Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules, Ambion社）と、そのmiRNAに特異的なmiRNA阻害薬（Anti-miRTM miRNA Inhibitor, Ambion社）をHL-60 培養細胞株へ遺伝子導入し、好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンを蛍光色素染色、フローサイトメトリーで、比較検討したい。
また、その結果に基づいて、ICU入室患者を対象に、1)非敗血症患者、2) 耐糖能障害の無い敗血症患者、3) 耐糖能障害の有る敗血症患者から採血後、好中球を抽出し、細胞培養研究で検討したHL-60細胞、好中球のmRNA、miRNA発現のデータの比較検討を行う予定にしている。
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| Causes of Carryover |
令和６年度に、以下の実験のための費用を支払う必要があるため。
外部委託業者に依頼した実験結果が出る予定になっているため、その費用の支払いをする必要がある。
また、その結果に基づいて、ICU入室患者を対象に、1)非敗血症患者、2) 耐糖能障害の無い敗血症患者、3) 耐糖能障害の有る敗血症患者から採血後、好中球を抽出し、細胞培養研究で検討した好中球のmRNA、miRNA発現のデータの比較検討を行う予定にしているため、その実験に費用が必要である。
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