悪性脳腫瘍に対するヒト脱落乳歯歯髄幹細胞を用いた新規腫瘍溶解ウイルス療法

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K09204
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 小泉 慎一郎 浜松医科大学, 医学部附属病院, 講師 (10456577)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 黒住 和彦 浜松医科大学, 医学部, 教授 (20509608)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞 / 腫瘍溶解ウイルス / グリオーマ幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

[グリオーマ幹細胞の培養増殖]：Massachusetts General Hospitalの脇本先生とMTA契約を締結して入手してあったグリオーマ幹細胞のMGG4, MGG8, MGG18, MGG23をそれぞれ幹細胞培養で増殖し、安定した継代・増殖のセットアップを確立した。ストックを作成した4種類のグリオーマ幹細胞をそれぞれ1×105 cellsずつヌードマウス脳内に投与し (n = 4)、MGGモデルマウスの作成に成功した。4種類のMGGモデルマウスでそれぞれ生存曲線を作成した。[腫瘍溶解ウイルス (oncolytic virus: OV)のセットアップ]：大臣確認実験の申請通過後、新規OVのHSV-P10およびRAMBOをそれぞれアフリカミドリザル腎臓由来のVero細胞に感染させ、ウイルスの複製・増殖を行った。複製したOVはスクロース遠心で精製し、他の実験に使用できるようにストックを作成した。[OVの抗腫瘍効果の検証]：精製したOVを段階的に感染多重度 (multiplicity of infection: MOI)を設定し、グリオーマ細胞株であるＵ-251およびLuciferase遺伝子を導入してあるU-87 MG-Luc2に感染させ、cell viability assayを行ってOVの抗腫瘍効果を確認した。[ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞 (stem cells from human exfoliated deciduous teeth: SHED)への感染実験]：精製したOVを段階的にMOIを設定してSHEDに感染させ、GFPの蛍光顕微鏡観察でSHED内でもOVが増殖しうることを確認した。また、OVを感染させたSHEDのcell viability assayを行い、SHEDに感染させる際のMOIの至適値を検証した。[腫瘍細胞とSHED-OVの共培養]：OVを感染させたSHED (SHED-OVとする)をグリオーマ腫瘍細胞株であるU-251およびU-87 MG-Luc2と共培養し、いずれの細胞でもOV単体の感染より優れた抗腫瘍効果を持つことが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画調書に記載した内容に概ね沿って実験することができ、また進度としても比較的順調に進行することができていると考える。

Strategy for Future Research Activity

SHED-OV自体のウイルス複製能を確認する。また、腫瘍細胞株にOV単体を感染させるより、SHED-OVを感染させた方がより抗腫瘍効果がみられたことを裏付ける機序を明らかにする (ウイルス複製能の評価、SHED自体の抗腫瘍効果の有無の検証)。また、SHED-OVが腫瘍に対する遊走能を維持しうるか確認する。上記の結果をもとに、in vivoでのSHED-OVの抗腫瘍効果の確認を行う。

Causes of Carryover

今年度、動物実験までの進行はなく計上していた実験動物購入費、一部試薬類や酵素類などの購入費が使用せず経過した。次年度はこれらを含めて、使用する予定である。