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2022 Fiscal Year Research-status Report

チェックポイント分子HIF1αをゲノム編集したNK細胞による膠芽腫治療法の開発

Research Project

Project/Area Number 22K09213
Research InstitutionNara Medical University

Principal Investigator

中澤 務  奈良県立医科大学, 医学部, 研究員 (00772500)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 松田 良介  奈良県立医科大学, 医学部, 学内講師 (60453164)
西村 文彦  奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (70433331)
Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords膠芽腫 / NK細胞 / CRISPR/Cas9 / HIF1α
Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的はチェックポイント分子HIF-1α遺伝子をCRISPR/Cas9で破壊したゲノム編集NK細胞を体外で誘導し、膠芽腫に対する抗腫瘍効果の解析や臨床応用に寄与できる細胞特性解析を行うことである。
本年度は以下の実験を行った。
①guide RNAの設計:HIF-1α遺伝子のゲノム編集に必要な2種類のguide RNAを設計し、同時にそのオフターゲット配列の候補も3種類程度予測した。
② ゲノム編集NK細胞の誘導:末梢血単核細胞よりT細胞を除去後、7日間培養。培養後のNK細胞にguide RNA/Cas9複合体を導入し、NK細胞の増殖率を評価した。
③ ゲノム編集効果の検証:培養後のゲノム編集NK細胞のHIF-1αの発現阻害効果をウェスタンブロット法を用いて検証した。また、PCR法を用いてゲノムDNAに対するオンターゲット、オフターゲット効果を確認した。
④ ゲノム編集NK細胞の網羅的遺伝子発現解析:ゲノム編集後に目的以外の遺伝子の発現に影響があるかどうかを確認するために、NK細胞に発現する活性化受容体やチェックポイント受容体の発現解析を行うためのデータ取得を行った。現在、Clariom SによるマイクロアレイとTAC (Transcriptome Analysis Console)を用いて遺伝子発現解析、KEGGパスウェイ解析、DAVIDやGSEAによるエンリッチメント解析を実施中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通りに研究が進んでいるため。

Strategy for Future Research Activity

今後は経学通りに以下の実験を行う予定である
④ ゲノム編集NK細胞の網羅的遺伝子発現解析:Clariom SによるマイクロアレイとTAC (Transcriptome Analysis Console)を用いて遺伝子発現解析、KEGGパスウェイ解析、DAVIDやGSEAによるエンリッチメント解析を実施する。
⑤ in vitro抗腫瘍効果解析:ゲノム編集NK細胞の膠芽腫細胞株(T98G、U251MG) に対する増殖抑制効果をRTCADP(ACEA社)を用いて評価する。測定後の上清中のサイトカインをELISA法で解析する。
⑥ 高度免疫不全マウスを用いたゲノム編集NK細胞の抗腫瘍効果解析:ヒトNK細胞やヒト膠芽腫細胞を効率的に生着させるために高度免疫不全NOGマウスを用いる。ヒト膠芽腫細胞U87MGをNOGマウスの脳内に移植し、ゲノム編集NK細胞を同所性に投与する。生存期間やmicro CT による腫瘍量の測定、腫瘍の組織学的評価を行う予定である。

Causes of Carryover

実験が順調に進み、マイクロアレイ解析まで行い始めたため。

  • Research Products

    (12 results)

All 2023 2022

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 2 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Journal Article] Natural Killer Cell-Based Immunotherapy against Glioblastoma2023

    • Author(s)
      Morimoto Takayuki、Nakazawa Tsutomu、Maeoka Ryosuke、Nakagawa Ichiro、Tsujimura Takahiro、Matsuda Ryosuke
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 24 Pages: 2111~2111

    • DOI

      10.3390/ijms24032111

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Intraoperative Ventricular Opening has No Effect on Complication Development Following BCNU Wafer Implantation for Malignant Glioma2023

    • Author(s)
      Matsuda Ryosuke、Maeoka Ryosuke、Tokuda Noriaki、Nakazawa Tsutomu、Morimoto Takayuki、Kotsugi Masashi、Takeshima Yasuhiro、Tamura Kentaro、Yamada Shuichi、Nishimura Fumihiko、Nakagawa Ichiro、Park Young-Soo、Nakase Hiroyuki
    • Journal Title

      World Neurosurgery

      Volume: 171 Pages: e707~e713

    • DOI

      10.1016/j.wneu.2022.12.090

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Establishment of an efficient ex?vivo expansion strategy for human natural killer cells stimulated by defined cytokine cocktail and antibodies against natural killer cell activating receptors2022

    • Author(s)
      Nakazawa Tsutomu、Morimoto Takayuki、Maeoka Ryosuke、Matsuda Ryosuke、Nakamura Mitsutoshi、Nishimura Fumihiko、Yamada Shuichi、Nakagawa Ichiro、Park Young-Soo、Nakase Hiroyuki、Tsujimura Takahiro
    • Journal Title

      Regenerative Therapy

      Volume: 21 Pages: 185~191

    • DOI

      10.1016/j.reth.2022.07.001

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Capability of Human Dendritic Cells Pulsed with Autologous Induced Pluripotent Stem Cell Lysate to Induce Cytotoxic T Lymphocytes against HLA-A33-Matched Cancer Cells2022

    • Author(s)
      Nakazawa Tsutomu、Maeoka Ryosuke、Morimoto Takayuki、Matsuda Ryosuke、Nakamura Mitsutoshi、Nishimura Fumihiko、Yamada Shuichi、Nakagawa Ichiro、Park Young-Soo、Nakase Hiroyuki、Tsujimura Takahiro
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 23 Pages: 12992~12992

    • DOI

      10.3390/ijms232112992

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Combined Treatment With Radiotherapy and Immunotherapy for Isocitrate Dehydrogenase Mutant Brainstem Glioma in Adult: A Case Report2022

    • Author(s)
      Morimoto Takayuki、Matsuda Ryosuke、Nakazawa Tsutomu、Nishimura Fumihiko、Nakagawa Ichiro
    • Journal Title

      Brain Tumor Research and Treatment

      Volume: 10 Pages: 129~129

    • DOI

      10.14791/btrt.2022.0009

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] CIS deletion with CRISPR/Cas9 enhances primary human NK cell functions against allogeneic GBM cells2023

    • Author(s)
      中澤務、前岡良輔、森本尭之、松田良介、中村光利、西村文彦、山田修一、中川一郎、中瀬裕之、辻村貴弘
    • Organizer
      第22回日本再生医療学会総会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] CRISPR/Cas9を用いたCIS欠損NK細胞の膠芽腫に対する抗腫瘍効果の検討2022

    • Author(s)
      前岡良輔, 中澤務, 森本尭之, 松田良介, 西村文彦, 中川一郎, 辻村貴弘, 中瀬裕之
    • Organizer
      第40回日本脳腫瘍学会学術集会
  • [Presentation] 膠芽腫スフェロイドモデルにおける遺伝子発現解析とNK細胞の傷害活性についての検討2022

    • Author(s)
      森本尭之, 中澤務, 松田良介, 西村文彦, 中村光利, 山田修一, 中川一郎, 朴永銖, 辻村貴弘, 中瀬裕之
    • Organizer
      第40回日本脳腫瘍学会学術集会
  • [Presentation] CIS deletion by CRISPR/Cas9 enhances human NK cell-mediated antitumor effects in glioblastoma2022

    • Author(s)
      前岡良輔、中澤務、森本尭之、松田良介、西村文彦、中村光利、山田修一、中川一郎、辻村貴弘、中瀬裕之
    • Organizer
      第26回日本がん免疫学会総会
  • [Presentation] Anti-tumor effect of genuine induced natural killer cells for glioblastoma in vitro and vivo study2022

    • Author(s)
      松田良介 、中澤務、森本尭之、前岡良輔、西村文彦、中川一郎、辻村貴弘、中瀬裕之
    • Organizer
      第26回日本がん免疫学会総会
  • [Presentation] Natural killer 細胞を用いた膠芽腫に対する細胞移植治療の基礎的研究2022

    • Author(s)
      松田良介 、中澤務、森本尭之、至田洋一、前岡良輔、 西村文彦、中川一郎、辻村貴弘、中瀬裕之
    • Organizer
      第22回日本分子脳神経外科学会
  • [Presentation] Ablation of the intracellular immune checkpoint molecule CIS potentiates antitumor effects against glioblastoma by unleashing the functions of NK cells derived from human peripheral blood.2022

    • Author(s)
      Nakazawa T, Morimoto T, Maeoka R, Matsuda R, Nishimura F, Nakamura M, Yamada S, Nakagawa I, Park YS, Tsujimura T, Nakase H.
    • Organizer
      The 51st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology

URL: 

Published: 2023-12-25  

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