エネルギー代謝における思春期特発性側弯症関連遺伝子LBX1の機能解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K09320
• Research Institution: National Defense Medical College
• Principal Investigator: 北村 和也 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 病院 整形外科, 講師 (00383860)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀内 圭輔 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 整形外科学, 准教授 (30327564)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 思春期特発性側弯症 / LBX1遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

思春期特発性側弯症（adolescent idiopathic sclerosis，以下AIS）は就学期の青少年の約2-3%に発生すると考えられている．AISでは容姿の問題だけでなく，悪化した症例では胸郭変形や胸腰椎の変形・変性が進み大きな障害を来たしうる．成長期終了以前に進行した症例に対してはインプラントによる矯正手術が適応となるが，手術は侵襲が大きく，合併症も無視できないことから，より有効な治療法・予防法の確立が強く望まれる．申請者の研究グループでは，AIS発症に関連した一塩基多型（single nucleotide polymorphism）を同定し，その近傍にLBX1遺伝子が存在することを過去に報告しており，継続して機能解析を行っている．これまでの研究から，骨格筋特異的にLBX1の発現を抑制した遺伝子改変マウス（以下Lbx1Δmusマウス）では，野生型マウスに比較し，前肢の低形成，加齢に伴う後弯変形，低体重などの表現型を示すことを明らかにし，論文報告した（Y. Matsuhashi. J Orthop Res. 2023 41(4):884-890）．本研究計画ではLbx1Δmusマウスが低体重であるという表現型に注目し，骨格筋に発現するLBX1のエネルギー代謝における機能の解析を試みた．これまでの研究から，Lbx1Δmusマウスは野生型マウスに比較して，摂食量自体には差を認めなく，運動量自体も低下しているのにもかかわらず，肥満抵抗性であり，基礎代謝が亢進しいていることを明らかにした．組織学的に骨格筋には異常を認めないが，脂肪細胞径が小さく，脂肪組織重量も野生型マウスに比較して有意に低下していることが観察された．また，Lbx1Δmusマウスの骨格筋の網羅的な遺伝子発現解析から，エネルギー代謝に関わる複数の遺伝子に発現量の変化を認めており，現在その検証とin vitroにおける機能解析を試みている．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

・上記のごとく，Lbx1Δmusマウスの表現型解析は順調に進行しており，これまで１）高カロリー餌食による肥満誘導に対して抵抗性を示すこと，２）ブドウ糖負荷試験にて糖負荷抵抗性を有すること，３）摂食量自体は野生型マウスと同程度であること，４）活動性は野生型マウスと比較し低下していること，５）トレッドミルによる最大酸素摂取量は亢進していること，６）基礎代謝の亢進を示すこと（基礎体温の上昇），などを明らかにした．一方，骨格筋の組織自体には大きな変化はなく，Ⅰ型，ⅡA型線維の割合には有意差を認めなかった．脂肪組織切片を基に脂肪細胞径を測定したところ，Lbx1Δmusマウスでは野生型マウスに比較して有意に低下し，脂肪組織重量も著しく減少していることが観察された．AIS患者は，正常な対象群と比較して，摂食障害は認めないものの，BMIが有意に低いことが知られており，本遺伝子改変マウスの表現型はこれらの点に関しては矛盾しないと考えられた．
・LBX1の標的分子の同定と，糖負荷抵抗性に対するメカニズムの解明のため，Lbx1Δmusマウスの骨格筋の網羅的な遺伝子発現解析を行い，エネルギー代謝に関わる複数の候補遺伝子を同定した．これらの遺伝子がLBX1の制御を受けているかの検証を行うため，まずは各種細胞株におけるLBX1の発現量を検討したが，LBX1を高発現する細胞株が同定できなかったた．このんため，LBX1の発現ベクターを作成し，強制発現の実験系を確立した．現在，この強制発現系のin vitro実験にて，候補に挙がった遺伝子の発現変動解析を行っている．

Strategy for Future Research Activity

Lbx1Δmusマウスの表現型解析は極めて順調に進んでおり，「骨格筋に発現するLBX1はエネルギー代謝に対し抑制的に機能する」という本研究の仮説を裏付けする結果が得られている．上記で述べた表現型解析関してはほぼ全ての事項に関して野生型マウスに比較して統計学的有意差が得られているが，さらＮを増やし，検証を深める計画である．LBX1を強制発現させた細胞株を利用したin vitroの実験では，候補として同定した遺伝子のうち3遺伝子が，Lbx1Δmusマウスの発現動態と矛盾しない挙動を示すことが明らかとなった．しかしながら，遺伝子の導入効率が必ずしも高くないことから，高発現した細胞株のクローニングを行い，さらに検証を行いたいと考えている．そのうえで，LBX1発現レベルによる糖取り込みの変化の検討，グルコースの細胞内の取り込みに中心的な機能を担うGLUT4の発現および，その上流にある細胞内シグナル分子であるIRS，PI3キナーゼ，AKTのなどの活性を評価する予定である．これらのデータが揃った時点（令和6年度中）で，論文化を目指す．

Causes of Carryover

他研究者との情報交換，ならびに研究成果を内外の主要な学会で発表し知見を広めるのは必須と考え，旅費を必要経費として計上したが，コロナ禍の影響もあり実際には旅費を使用しなかった．次年度以降は研究遂行に加え，旅費と英論文作成費を含め，使用する予定である．