2023 Fiscal Year Research-status Report
Role and regulatory mechanism of the stress-responsive protein Nupr1 in bone formation and bone aging
| Project/Area Number |
22K09360
|
|---|
| Research Institution | Saga University |
|---|
Principal Investigator |
久木田 明子 佐賀大学, 医学部, 客員研究員 (30153266)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
馬渡 正明 佐賀大学, 医学部, 教授 (80202357)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | 細胞老化 / 骨細胞 / Nupr1 / HtrA1 / 骨粗鬆症 / 遺伝子欠損マウス |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
今までの研究からNupr1遺伝子欠損（KO）マウスは、野生型マウスと比較して、加齢による骨量の減少が低下しており、骨細胞の細胞老化形成が減少していると考えられた。本年度では、さらに加齢マウス（19カ月令雄）と若齢マウス（６カ月令雄）を用いて詳細な細胞老化関連遺伝子の解析を行った。細胞老化マーカー遺伝子であるp21やp16や、RANKL, MMP13などのSASPやSA-betaガラクトシダーゼ遺伝子Glb-１及び細胞老化の転写制御因子GATA４が、加齢マウスの骨細胞で発現が増加していたが、Nupr１KO加齢マウスは野生型加齢マウスと比較しこれらの老化関連遺伝子の発現が顕著に低下していた。一方、加齢マウス骨細胞では顕著に減少する核ラミンB1は、Nupr１KOマウスでは大きな減少がみられなかった。これらの結果から、Nupr１は骨細胞の細胞老化を制御すると考えられた。さらに、加齢による骨の脆弱性に関わる骨のミネラル化を測定した結果、野生型マウスと比較しNupr1KOマウスではミネラル化が低下していた。また、前回Nupr1 KOマウスで発現が顕著に低下する骨の石灰化に関与するセリンプロテアーゼHtrA1を見出したが、HtrA1にはHtrA1-4の仲間があることから、骨芽細胞での発現とNupr1のKOのそれぞれの発現への作用を調べたところ、HtrA1とHtrA3の発現が骨芽細胞では特に高くNupr１KOマウスではそれらの発現が低下した。そこで、HtrA1、２，3のshRNAレンチウイルスを作成し骨芽細胞に感染させHtrA1，2，3の発現を低下したときの骨芽細胞の分化について検討したところ、HtrA1とHtrA3の発現を低下させると骨芽細胞の石灰化がやや促進するという傾向が見られた。Nupr1がHtrA1とHtrA３を介して骨芽細胞分化に関わる可能性が示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以前の申請者らの研究から、Nupr1の欠損により加齢による骨細胞の老化細胞の形成が低下していると考えられたが、今回加齢マウスや比較する若齢マウスの匹数や老化関連遺伝子の解析を増やしてさらに解析を行った。RT-PCR法によりp16やp21、SASPであるRANKLやMMP13やGlb-1やlaminb1老化関連遺伝子の発現解析を行い、Western法によってGATA4とLaminB1の解析も行った。その結果、いずれの場合も、Nupr1を欠損した加齢マウスの骨細胞では、加齢マウスで増加あるいは低下する細胞老化の指標が、野生型マウスと比較して減弱しており、Nupr1が細胞老化形成に関わることを確かめることができた。また、骨芽細胞ではSMAD2とSMAD1/5/9のシグナルの解析を行い、Nupr1欠損は骨形成を阻害するSMAD2シグナルには影響しなかったが、骨芽細胞分化の初期でSMAD1/5/9のリン酸化を減弱することも確認した。またNupr1の欠損が、HtrA1のファミリーの中で特にHtrA1とHtrA3の発現を低下させた。これらのことから、Nupr1は骨芽細胞分化の初期でHtrA1やHtrA3を介して骨芽細胞分化を制御するという新たな制御機構を示唆する結果を得ることができた。Nupr1阻害剤の実験については進行中である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今までに得られた網羅的遺伝子発現解析などの結果をもとに、Nupr1とHtrA1との関係、そのメカニズムについて解析及び考察を行っていきたい。また、現在進行中であるが、いくつかのNupr1阻害剤を様々な濃度や期間を変えてin vitroの骨芽細胞分化培養系に添加して、骨形成や老化細胞形成に対する効果を解析する予定である。
|
| Causes of Carryover |
予定より、マウスの飼育費や試薬などを少なくすることができたので、少量の次年度使用額が生じた。次年度では、新たな試薬等を購入し実験に使用する予定である。
|
