2022 Fiscal Year Research-status Report
Mechanical stress response of senescent osteocytes: an intercellular communication between bone resident cells mediated by specific secreted factors.
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22K09403
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
上原 範久 九州大学, 歯学研究院, 助教 (30368211)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | osteocyte / senescence / osteoblast / mechanical stress |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨細胞は、力学的刺激に対する生化学的応答(メカノトランスダクション)として、液性因子の分泌を介して骨代謝や筋肉機能を調整する重要な役割を担っている。加齢に伴い、骨組織には老化した骨細胞が蓄積することが報告され、その特異的分泌因子(SASP因子)は骨量減少の要因の一つになっている。しかしながら、老化骨細胞が分泌する特異的SASP因子とそれら分泌因子を介した細胞間相互作用、ならびに老化骨細胞メカノトランスダクション機序について多くの疑問が残されている。
当該年度は、老化骨細胞のメカニカルストレス応答における新規SASP因子の同定を行うために、マウス骨細胞株MLO-Y4に300 nMドキソルビシン処理を行い、細胞老化を誘導した。その結果、約７割の細胞でベータガラクトシダーゼおよびγH2AX 陽性が確認された。正常MLO-Y4細胞と老化MLO-Y4細胞は、それぞれロッキングシーソー上で機械的刺激（0.08 Pa）を与えた後、培養上清（conditioned medium; CM）を回収し、マウス骨髄間質細胞株ST2および骨格筋細胞株C2C12のin vitro分化実験系に用いて、その分化・機能に及ぼす影響を検討した。その結果、老化骨細胞由来CMは、正常骨細胞由来CM処理と比較して、ST2細胞の石灰化を顕著に抑制した。興味深いことに、機械的刺激を与えた老化骨細胞由来CMは、ST2細胞の石灰化抑制を改善することを見出した。すなわち、老化骨細胞より骨芽細胞石灰化を抑制する因子が含まれており、その因子の効果は、機械的刺激により減弱することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
老化骨細胞由来メカノストレス応答分泌因子を介した骨代謝細胞および骨格筋細胞とのクロストーク機序の解明に当たり、まず骨細胞のin vitro細胞老化誘導実験系の構築を行った。マウス骨細胞株MLO-Y4細胞へドキソルビシン処理を行うことで、DNA損傷誘導による骨細胞老化誘導に成功した。正常MLO-Y4細胞と老化MLO-Y4細胞は、ロッキングシーソー上で機械的刺激（0.08 Pa）を与えた後、培養上清（conditioned medium; CM）を回収し、マウス骨髄間質細胞株ST2および骨格筋細胞株C2C12のin vitro分化実験系に用いて、その分化・機能に及ぼす影響を検討した。その結果、老化骨細胞由来CMは、正常骨細胞由来CM処理と比較して、ST2細胞の石灰化を顕著に抑制した。興味深いことに、機械的刺激を与えた老化骨細胞由来CMは、ST2細胞の石灰化抑制を改善することを見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究計画として、正常および老化骨細胞に対して力学的刺激を行い、RNAseq解析およびバイオインフォマティクスによるパスウェイ解析を行い、メカニカルストレスに対する老化骨細胞の分子動態を正常骨細胞との発現比較をおこない、分泌表現型の特徴を精査する。加えて骨細胞老化の機械的刺激に対する感受と応答に関する特異的分子に関して、qPCR、ウェスタンブロットならびにELISA アッセイによりその発現を確認するとともに、その機能について検討する。
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| Causes of Carryover |
本年度研究計画の骨細胞のin vitro細胞老化誘導実験系の構築において、条件設定など想定より早くモデル実験の構築に成功できたことや、必要とする細胞等の実験用の試料が研究協力者からの譲渡でまかなうことができたため、本年度の予算を抑えることができた。
次年度予算に関しては、当初の予定通り、主にRNAseqの受託解析の費用として使用するが、前年度未使用予算とあわせ、さらに実験サンプルの追加と詳細な解析を行う予定である。
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