2022 Fiscal Year Research-status Report

Development of an Animal Model for Local Spinal Cord Foci of Okinawa ALS and Search for Surgical Treatment; Regulation of Mutant TFG Expression

Research Project

Project/Area Number	22K09428
Research Institution	University of the Ryukyus
Principal Investigator	神里興太琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10554454)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	垣花学琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20274897)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	神経原性筋萎縮症 / 遺伝子治療
Outline of Annual Research Achievements	本申請研究では「脊髄局所における変異型TFG増加により沖縄型神経原性筋萎縮症（沖縄型ALS）モデルラットを作成し、外科的遺伝子導入による治療法を開発する」ことである．具体的には以下の計画を推進中である．（１）脊髄局所における変異型TFG発現（TFGP285L）を増加させることで沖縄型ALSモデルを確立，（２）神経細胞死による運動機能変化と病理学的検討，（３）TFGP285L発現を外科的介入による沖縄型ALS病状進行停止を模索．低侵襲な成熟個体への遺伝子導入の方法として「軟膜下投与法」を開発し脊髄に障害を与えることなく効率的な遺伝子導入が実施可能となり、本申請研究でも採用している．予備実験として、使用するラット（SD系）を用い緑色蛍光タンパクGFPを過剰発現させる試みを実施した。本実験として以下の検討が進行中である。 Ⅰ）プラスミド・ウイルスベクター作成：使用する変異TFGプラスミドは，培養神経細胞を用いてその細胞障害効果を判定したのち，AAV9を作成する．沖縄型ALSで報告された遺伝子変異（TFGP285L）をターゲットとしAAV9を作成を開始した．神経特異性を高めるためプロモーターとしてSynaptophysinを使用することとし、作成中である。 Ⅱ ）ラット軟膜下投与によるTDP-43断片化C末端遺伝子導入とその評価：雄性ラットの胸椎Th11/12椎弓切除を施行する．その椎弓切除部分の硬膜を切開することで脊髄腰髄膨大部を露出する．軟膜を30G軟膜切開針で切開した後，軟膜下投与用鈍針を軟膜下挿入する．経注入針的にAAV9-Syn-mTFGP285Lを注入する．今後、14日毎に下肢運動機能とALSモデル動物で行われている電気生理学的検査（muscle fibrillation）の評価を行う。神経機能の客観的評価を行い、症状発現を観察する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初感染効率を高めるため、ubiquitinをプロモーターとするウイルスベクター作成を試みたが、神経特異性を高めたSynaptophysinをプロモーターとしたAAV9-Syn-mTFGP285Lを再設計した。UBCとSynの生体内における感染効率の確認が必要で、運動神経細胞に対する感染効率（＝遺伝子導入効率）の確認に時間を要している。In Virto、in Vivo両面からの確認を進める計画である。それ以外の手術の手技の確認等は問題なく経過している。
Strategy for Future Research Activity	当初の計画通り実験を推進するがより効率的なベクター設計は並行して推進する予定である．本年度中にウイルスベクターの生体内投与と効果発現（＝神経細胞死）の評価を実施する計画である． Ⅰ）プラスミド・ウイルスベクター作成：本年度も継続する．使用する変異TFGプラスミドは，培養神経細胞を用いてその細胞障害効果を判定したのち，AAV9を作成する． Ⅱ ）ラット軟膜下投与によるTDP-43断片化C末端遺伝子導入とその評価：本年度実施予定．雄性ラットの胸椎Th11/12椎弓切除を施行する．その椎弓切除部分の硬膜を切開することで脊髄腰髄膨大部を露出する．軟膜を30G軟膜切開針で切開した後，軟膜下投与用鈍針を軟膜下挿入する．経注入針的にAAV9-Syn-mTFGP285Lを注入する．下肢運動機能と電気生理学的検査（muscle fibrillation）の評価を行い，神経機能の評価を行う（14日毎）． Ⅲ ）ラット脊髄の免疫組織学的評価など：電気生理学的変化が認められた場合，その前後の時期も含め脊髄の病理学的変化を免疫組織学的に評価する．具体的には脊髄前角の運動神経減少率や残存している運動神経細胞内におけるTDP-43の分布を評価する（蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡）．同時にWestern blottingによりTDP-43，TFGそれぞれのタンパク発現量の定量を行う．本申請研究では感染効率の最適化は重要であるが、疾患モデルの確立という点から神経細胞特異的なベクターと細胞選択性がないベクターのどちらが症状発現にとって有利であるか不明なため、どちらのベクターも作成し、使用する計画としている。具体的に現在計画しているのはAAV9-Syn-mTFGP285LとAAV9-UBC-mTFGP285Lである．
Causes of Carryover	実験に使用しているの物品（薬剤）の事務手続き上の間違いにより予算使用額に差が生じた。当該薬剤は次年度追加使用予定があるため当該金額分購入予定である。