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2023 Fiscal Year Research-status Report

尿失禁に対する新規再生医療の開発へ向けた外尿道括約筋幹細胞セクレトームの機能解析

Research Project

Project/Area Number 22K09451
Research InstitutionOita University

Principal Investigator

秦 聡孝  大分大学, 医学部, 教授 (60404381)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 三股 浩光  大分大学, 医学部, 教授 (60219714)
安藤 忠助  大分大学, 医学部, 准教授 (20433047)
澁谷 忠正  大分大学, 医学部, 助教 (20601149)
羽田 真郎  大分大学, 医学部, 助教 (90773838)
篠原 麻由香  大分大学, 医学部, 客員研究員 (30774666)
濱松 典子  大分大学, 医学部, 特任助教 (10943996)
Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Keywordsセクレトーム / 外尿道括約筋 / 外尿道括約筋衛星細胞 / 膀胱平滑筋細胞 / 線維芽細胞
Outline of Annual Research Achievements

外尿道括約筋は膜様部尿道を取り囲む横紋筋で、尿禁制に寄与している。しかし加齢に伴い外尿道括約筋細胞は減少しており、筋細胞は脂肪細胞や線維組織に置換されて括約筋機能が低下し、これが高齢者の尿失禁の一因と考えられている。
本研究では尿失禁に対する新規再生医療の開発に向けて、ヒト外尿道括約筋幹細胞の培養上清である「セクレトーム」を用いたrational確立に向けて様々な実験を行う。
インフォームドコンセントの得られた膀胱全摘症例より、手術時に外尿道括約筋組織外尿道括約筋の微量組織を細切し、コラゲナーゼ処理後に初代培養を行った。分離培養した外尿道括約筋幹細胞にCSII-CMV-TERTを遺伝子導入し、さらに横紋筋幹細胞マーカーであるCD56(NCAM)に対する蛍光抗体を用いてフローサイトメーターによって横紋筋幹細胞を分離し長寿化細胞株を樹立した。これまでに8例の外尿道括約筋組織の初代培養を行っており、4例に長寿化遺伝子を導入して3例の長寿化細胞株を樹立した。これらの細胞株については分化・増殖実験を行い横紋筋に分化することを確認した。同時に膀胱平滑筋細胞、線維芽細胞についても初代培養を行い同様に分離を行った。
今年度は当教室で樹立した長寿化外尿括約筋細胞を用いて幹細胞から分泌されるセクレトーム解析のための上清回収・濃縮・を行いGC-MS解析の予備実験を行った。培養した外尿道括約筋前駆細胞の増殖実験、分化実験(分化前期・後期)の培養上清を回収した。それぞれのサンプルを実験実習機器部門に依頼してGC-MSの測定を行った。得られた代謝産物の結果をSIMCA解析ソフトを用いてメタボローム解析を行っている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

R3年度から大学による改修工事が行われており当教室の実験室の立ち上げに時間がかかった。また共通実験施設である実験実習機器センターも改修工事後の立ち上げがR5年となり、実施可能な実験が制限されるなど実験を行う時間等が厳しく減ったことで計画に遅れが生じたが、新たな外尿道括約筋細胞株の樹立と共に膀胱平滑筋細胞の分離、線維芽細胞の分離培養は成功している。
今年度は当教室で樹立した長寿化外尿括約筋細胞を用いて幹細胞から分泌されるセクレトーム解析のための上清回収・濃縮・を行いGC-MS解析の予備実験を行った。培養した外尿道括約筋前駆細胞の増殖実験、分化実験(分化前期・後期)の培養上清を回収した。それぞれのサンプルを実験実習機器部門に依頼してGC-MSの測定を行った。得られた代謝産物の結果をSIMCA解析ソフトを用いてメタボローム解析を行っている。
来年度は外尿道括約筋前駆細胞の分化におけるメタボローム解析を行うためのGC-MS測定の本実験を行うと共に、外部委託によるセクレトーム測定実験を行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

引き続き長寿化外尿道括約筋細胞の培養実験を行い、増殖・分化におけるセクレトーム解析のためのサンプル調整・濃縮・たんぱく質測定系の構築を行う。培養上清はGC-MSを測定してメタボローム解析を行い、分化における代謝のパスウェイ解析を行う予定である。
また、外部委託によるセクレトーム解析により、細胞外小胞の多様性に着目してエクソソーム・マイクロベクシルの解析も行い細胞外小胞のタンパクの同定を行う。
さらに、初代培養で分離した膀胱平滑筋細胞及び線維芽細胞との共培養や、外尿道括約筋細胞の上清添加の実験を行いそれぞれの細胞の増殖・生存・細胞形態の変化(特に分化能や分化様式)などを検討する。プロテオーム解析やエクソソーム解析については受託サービスに託して実験を行う予定である。

Causes of Carryover

R3年度からの大学による改修工事に伴い、当講座の実験室の立ち上げ時期の遅延及び共通の実験実習機器センターの機器部門が一部閉鎖となった。そのため実施可能な実験が制限されるなど実験を行う時間等が厳しく減ったことにより計画に遅れが生じた。実験実習機器に委託実験のGC-MSデータの予備実験等にとどまり、試薬購入等の経費の繰越予算が生じた。
来年度はGC-MSを用いたメタボローム解析の本実験、さらに外部委託のセクレトーム解析を予定しており、そのための試薬購入や解析実験の費用に充てる予定である。

  • Research Products

    (1 results)

All 2023

All Presentation (1 results)

  • [Presentation] Decorinが外尿道括約筋細胞の増殖分化に与える影響2023

    • Author(s)
      篠原 麻由香
    • Organizer
      日本排尿機能学会

URL: 

Published: 2024-12-25  

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