機能的な構造を有する腎・尿路再生への選択的細胞抽出法を応用した基礎的研究

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K09481
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 中根 明宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70464568)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 大貴 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (00620931) ; 西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (10621063) ; 林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134) ; 安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153) ; 丸山 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50305546) ; 水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 再生医療 / 腎 / ES細胞

Outline of Annual Research Achievements

遺伝子導入ES細胞であるPax2 ES細胞を、Glasgow MEMにFCS、2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、sodium pyruvate、LIFを加えたもので培養 し、次にPax2 ES細胞をhanging drop法を用いembryoid body (EB)を形成させた。5日後にEBを再度ディッシュ上で数日間分化を進めて細胞塊を回収した。さらに 5、10日目でEBを回収した。EBの遺伝子発現の確認をするため、ディッシュに平面培養したES細胞およびEBを0.25%トリプシンEDTA溶液にて回収し、mRNAを抽出、 2-プロパノール、エタノールにて沈殿させ回収した。回収したEBに目的の遺伝子が発現しているかどうかをRT-PCR法を行った。回収したEBはRT-PCR法でPax2遺伝 子が発現していることが確認できた。また他の腎発生の各段階で発現 して くる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認したところ、aquaporin-1、 Integrin a8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められた。そこ で、これらのEBをPax2発現細胞に対し、Pax2で標識した細胞を回収する条件でFACSを 行い、細胞回収を行った。これらの細胞に対し、再度上記の遺伝子の発現が 上昇しているかをRT-PCR法で確認したところ、aquaporin-1の上昇が確認できた。さらに、Podcinが上昇した条件での培養細胞からFACSを行い、目的の細胞が得られているか確認中である。今後、さらに他の培養条件を試し、違う性質の細胞が回収できるかを繰り返しながら、標的の細胞への分化が起こっているかの確認を継続する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初期段階の細胞分化の確認はできたものの、目的となる細胞の発現遺伝子は確認や候補の選定に時間を要しており、他の培養条件での遺伝子発現が確認することが必要であるため。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、追加された知見を取り入れながら、培養条件決定を継続する。

Causes of Carryover

腎・尿管発生に重要な遺伝子Pax2をES細胞に遺伝子導入し、培養・分化させる計画であったが、培養・分化が計画通りの結果が得られなかった。遺伝子導入や培 養系の方法の見直しを行い計画自体は進めているが、学会などでの発表は行えなかった。遺伝子導入・培養。分化は完結し、Embryoid body(EB)の遺伝子発現の確認を行っていきたい。