Elucidation of renal spontaneous immune tolerance focusing on plasmacytoid dendritic cells - therapeutic strategies for induction of human renal immune tolerance

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K09514
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 篠田 和伸 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (60348737)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 免疫寛容 / 制御性形質細胞様樹状細胞 / siglec-H / 腎移植

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、マウス腎移植モデルにおいて、免疫抑制剤無しでアロ抗原に対する免疫寛容が成立する「腎自発免疫寛容」のメカニズムを解明することを目的としている。先行研究で、制御性形質細胞様樹状細胞（制御性pDC）がアロ腎移植モデルにおいて腎自発免疫寛容成立のために重要であることが示唆されたが、特にそのマーカーの一つであるsiglec-Hに着目し研究計画を立案した。本年度はpDC特異的にジフテキアトキシンレセプター（DTR）を組み込んだ遺伝子改変マウス（Siglech-DTR）を繁殖する予定でいた。このマウスにジフテリアトキシンを投与することでpDC(Siglec-H陽性細胞)を特異的に消去することが可能であり、腎自発免疫寛容のメカニズムにおけるpDCの役割をより詳細に評価することができる。本年度は繁殖室の調整に時間がかかり、Siglech-DTRマウスを実験有効数まで繁殖させるまでには至らなかった。実験進捗状況としては、マウス腎移植モデルをIsogfraftを用いて多数の腎移植を行い、一定の確率での成功率が得られた。次年度、siglech-DTRの繁殖が順調にすすめばすぐにでも実験にとりかかれる準備は整っている。また、免疫応答評価のため混合リンパ球試験（MLR）を行う予定でいるが、これに関してはResponder細胞をCFSE染色して、4-6日目の免疫応答後の分裂細胞割合をFlowcytometryで評価を行った。Stimulatorとしてビーズ（CD3, CD28）とアロ細胞を用いて比較を行ったが、MLRにより同等の細胞分裂反応を検出することができ、in vitroのCFSE-MLRの系はほぼ確立できたと考えている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、遺伝子組み換え動物飼育室に、他の実験系で用いる遺伝子組み換え動物を多数飼育していたため、本研究で用いるSiglech-DTRマウスの繁殖スペースを確保することが困難であったため、実験系で用いる有効飼育数まで到達することができなかった。しかしながら、マウス腎移植モデルの確立と生着率の安定、またin vitro実験系におけるCFSE-MLRの系は安定して確立することができた。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、先行研究を早期に終了させ、遺伝子組み換え動物飼育室に繁殖スペースを確保し、本研究で用いるSiglech-DTRの安定した繁殖に取り組むことを最優先目標とする。また、腎移植モデルは定期的に実施し、生着率をさらに向上させひとたびSiglech-DTRが実験で使えるようになった際に、安定した結果がすぐに出せるように準備を行っていく。In vitroアッセイでは、CFSE-MLRによるDirect Pathwayの免疫応答反応の検出はほぼ問題なくできるようになったため、次のステップとしてアロ臓器蛋白を用いたIndirect Pathwayによる免疫応答反応検出の系を確立していくことを目標とする。

Causes of Carryover

端数の金額が残ってしまったため、次年度購入予定のリンパ球混合培養用ビーズの購入に充当する。