ES/iPS細胞由来網膜移植の機能的生着向上のためのホスト網膜環境に関する研究

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K09826
• Research Institution: Kobe City Eye Hospital
• Principal Investigator: 万代 道子 地方独立行政法人神戸市民病院機構神戸市立神戸アイセンター病院(診療部、研究センター), 研究センター, 研究センター長 (80263086)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 網膜変性 / 水平細胞 / 網膜オルガノイドシート移植 / 多電極アレイ / 電子顕微鏡 / 視細胞シナプス

Outline of Annual Research Achievements

Correlative light and electron microscopy（CLEM)技術を用いた電子顕微鏡を用いてのシナプス観察については現在論文作成中である。水平細胞欠失網膜変性マウスへの網膜オルガノイドシート移植後検証については、シナプス計数のプロトコルをさらに最適化し、従来の網膜変性マウスおよび水平細胞欠失網膜変性マウスそれぞれの移植後において、ホスト-グラフト間の視細胞シナプス数を比較したところ、移植組織とつながるホスト双極細胞数、ホスト双極細胞あたりのホスト-グラフト間のシナプス数、共に有意な差をみとめなかった。また、電顕観察より先行する水平細胞貫入が確認されたことから、免疫学的染色とあわせて、水平細胞欠失網膜変性マウスにおいては移植組織側の水平細胞がホスト-グラフト間視細胞シナプス形成に寄与していることが示唆された。一方で、網膜変性マウス(rd1)においては視細胞の消失後、水平細胞も徐々に失われていくことを確認、このことは、水平細胞が減少するような末期網膜変性においても、水平細胞を持つ網膜組織移植においてはシナプス形成が可能であることが示唆された。
さらに、ホスト網膜変性マウスの水平細胞の有無がどのように機能に影響を与えるか調べるために、多電極アレイの刺激装置を改良し、より詳細に光強度の変化、異なる背景光上の光強度変化、フリッカー刺激、背景光上でのchirp刺激などを行い、まずは水平細胞が存在する網膜変性マウスでの移植後網膜の機能を評価した。末期網膜変性への移植部位において、移植前さらに早期でもみられなかったような薄明光に対する光応答が得られることがわかり、また正常網膜ほどではないが移植部位では~5Hz程度のフリッカー刺激光に追従する神経節細胞の反応が確認でき、移植後網膜がある程度の時間解像度をもって刺激光に反応することを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

電子顕微鏡観察については専門家の助言もうけて、その解釈が深まり、論文作成段階まで到達した。また水平細胞の先行貫入についても確認できた。多電極アレイについてもさまざまな光刺激が可能となり、より詳細な網膜オルガノイド移植後の機能解析が可能となり、今後どのような条件がどのような効果に結びつくか、といった本質的な研究も可能となる基盤ができた。

Strategy for Future Research Activity

引き続き解析を行うことにより、水平細胞の有無がどのように移植後シナプス形成に影響が与えるかを検証し、またよりよい移植後機能を得るための手がかりとする。ホスト水平細胞有無によるシナプス形成の電顕像での比較も予定しており、どのように移植後のシナプスが形成されるかを観察し、ホストの変性段階や環境が移植後シナプスにどう関与するかを考察する。また、より詳細な網膜機能解析が可能となったことから、具体的にどのようなシナプス形成がどのような機能に反映されるかも検証をすすめていく

Causes of Carryover

購入希望物品の手配ができず、次年度に購入予定であるため