2022 Fiscal Year Research-status Report
歯周病原細菌の9型分泌機構における選択的分泌メカニズムの解明
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22K09928
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
庄子 幹郎 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10336175)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
雪竹 英治 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (30380984)
浜本 洋 帝京大学, 付置研究所, 准教授 (90361609)
内藤 真理子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (20244072)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 歯周病細菌 / タンパク質分泌機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ジンジバリス菌のPorEの欠損株は血液寒天培地上で白色コロニーを示した。PorEはリポタンパク質であり外膜の内葉にあると推測されている。PorEはTPR, PD40, Carbo, OmpAという4つのドメインからなる。PorEの欠損株にPorE, PorE[PD40欠損］, PorE[Carbo欠損］, PorE[OmpA欠損］ をporE遺伝子欠損部位に相補させる株の作製に成功した。その結果、PorE[PD40欠損］は安定的に発現せず議論できなかった。PorE[Carbo欠損］は安定的に発現しPorE欠損株を相補した。PorE[OmpA欠損］は安定的に発現したもののPorE欠損株を相補できなかった。つまりPorEのOmpAドメインがジンジパイン活性に重要であると示唆された。
つぎにPorEのOmpAドメインのリコンビナントタンパク質はペプチドグリカンに結合するという報告がある。結合サイトである2か所のアミノ酸をアラニンに変異したPorE[D576A/N584A］をporE遺伝子欠損部位に相補させる株の作製に成功した。その結果、ジンジパイン活性は相補できなかった。つまりPorEのOmpAドメインのペプチドグリカン結合サイトがジンジパイン活性に重要であることが示唆された。
PorEの局在解析を調べた。PorEは主に外膜画分に検出された。一方、PorE[Carbo欠損］および PorE[OmpA欠損］は主に細胞質/ぺリプラスム画分に検出された。つまりPorEの部分欠損型は局在に変化があることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PorEの4つのドメインのうち3つのドメインの欠損株作製の性状解析を行うことができた。残り1つのドメインの欠損株作製を試みている。また、抗体作製に成功しPorEの局在を調べることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
① PorEとPorPは複合体を形成するという報告がある。したがって、PorE発現におけるPorPの役割を調べる。② PorE欠損株においてPorAおよびHbp35の分泌が行われているという知見を得ている。それらの知見はPorE欠損株を用いて抗PorA抗体, 抗Hbp35抗体を用いたイムノブロット法にてA-LPS結合型のスメアバンドが検出されることで確認できる。詳しく述べるとA-LPS結合型のスメアバンドは「PorU sortaseがT9SS分泌タンパク質のCTDを切断した後にそのC末端側でA-LPSと共有結合する」からである。PorE欠損株で見られたPorAおよびHbp35のA-LPS結合型のスメアバンドがT9SS依存性もしくはA-LPS依存性であるか否かを二重変異株を作製することで調べる。③ PorP欠損株においてもPorAおよびHbp35の分泌が行われているという知見を得ている。上記2と同様の実験を行いPorE欠損株と同じ表現型であるか否かを調べる。④ PorE欠損株の性状解析はW50株で最初に報告された。私たちはATCC 33277株のPorE欠損株はW50株のそれと同様の表現型であることを確認した。ゲノム上W50株に比較的近い関係にあるW83株でもPorE欠損株が同様の表現型であるかを調べる。
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| Causes of Carryover |
研究計画に必要な試薬を一部省略することができ購入せずに済む場合があった。次年度には未使用金額を上乗せして全額使用するようにする。使用計画として、免疫沈降実験に必要な細菌破砕試薬である「BugBuster」の購入に充てる予定。
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