2022 Fiscal Year Research-status Report

歯周病原細菌などのバクテロイディア綱細菌固有のリポタンパク質輸送機構の解明

Research Project

Project/Area Number	22K09941
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	雪竹英治長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (30380984)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	庄子幹郎長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10336175) 内藤真理子長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (20244072) 浜本洋帝京大学, 付置研究所, 准教授 (90361609)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	歯周病細菌 / 線毛 / リポタンパク質
Outline of Annual Research Achievements	ジンジバリス菌のリポタンパク質を菌体表面に分泌させるレポーター系の構築に成功した。具体的には、本菌のFim線毛の主要構成タンパク質であるFimAをモデルとして、FimAのN末端側50アミノ酸にルシフェラーゼを結合させるもの(FimAsigN-nLuc),さらにC末端にHisタグをつけたもの(FimAsigN-nLuc-His),リポタンパク質結合サイトである19番目のシステインをアラニンに置換したもの(FimAsigNC19A-nLuc-His)を構築し、mfa1mfa2遺伝子内に挿入し異所性にかつanhydrotetracycline(aTC)の誘導剤添加による一過性の発現系を構築した。その結果、aTC添加存在下でFimAsigN-nLuc, FimAsigN-nLuc-Hisは培養上清/菌体の比率がともに30倍以上であった。一方、FimAsigNC19A-nLuc-Hisは同条件下で培養上清/菌体の比率は約0.25倍であった。培養上清と菌体に分画して抗His抗体でも同様の知見が得られた。次に、外膜を通過するメカニズムについて検討した。これまでに脂質が修飾されるシステイン以降の極性アミノ酸が外膜通過に重要であることが報告されている。上記の系で19番目のシステイン以降の極性アミノ酸、KDEEEを5つのアラニンに置換したもの、KDEを3つのアラニンに置換したものについて、aTC添加存在下で発現させたのち培養上清と菌体に分画して抗His抗体で分泌の有無を調べた。その結果、上記2つの置換体は培養上清に分泌されないことがわかった。一方、大腸菌でFimAsigN-nLuc-HisをIPTGで一過的発現を行っても培養上清に分泌することはなかった。つまり、FimAタンパク質の19番目のシステイン以降の極性アミノ酸が外膜通過に重要であること、また本菌特有であることがわかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ジンジバリス菌における一過的タンパク質発現システムを構築に成功し、線毛主要構成タンパク質をモデルタンパク質として誘導剤添加による一過的に発現させることに成功した。また、脂肪酸付加さいとであるシステイン以後の極性アミノ酸が菌体表面分泌に重要であることを明らかにすることができた。現在、その知見を含む論文を投稿中である。
Strategy for Future Research Activity	①ルシフェラーゼレポーター系にてFimAタンパク質の19番目のシステイン以降の極性アミノ酸が外膜通過に重要であることがわかったことから、実際にFimAタンパク質の19番目のシステイン以降の極性アミノ酸を変化した場合、線毛形成に影響を及ぼすか否かを調べる。具体的にはイムノブロット法、ドットブロット法、セルフラクショネーション法にて調べる。② 上記①の実験で極性アミノ酸の置換が分泌に影響を及ぼす結果になった場合、脂質転移反応に影響が及んでいないかを調べる。具体的には、FimAタンパク質に放射ラベルパルミチン酸の付加が起きるか否かを調べる。③ リポタンパク質の輸送分子の特定を試みる。具体的にはFimAタンパク質の一過的な発現系を構築し、aTC誘導剤を添加しあまり時間が経過していない条件下から免疫沈降を行い、FimAタンパク質に結合する分子の同定に取り組む。④ 外膜にあるタンパク質に着目し輸送分子となる候補を選び出し、その遺伝子の変異株を作製しFimAタンパク質の重合形成に影響があるものを調べる。具体的には、TPRドメイン含有タンパク質またはTonBシステム系タンパク質などである。⑤ FimAタンパク質の一過的な発現系を用いて、阻害剤ライブラリーを添加しFimAタンパク質の重合形成を阻害するものを探索する。
Causes of Carryover	予定していた実験を省略することができたために未使用金が生じた。次年度に未使用金を繰越し、未使用金が生じないよう計画的に実験を行う。使用計画については、ジンジバリス菌のイムノブロット解析の際に使用するタンパク質分解酵素阻害剤「TLCK」の購入に充てる予定。