2022 Fiscal Year Research-status Report
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22K09996
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
永田 有希 東京医科歯科大学, 統合研究機構, 助教 (50405841)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
須藤 毅顕 東京医科歯科大学, 統合教育機構, 特任助教 (10821168)
田中 敏博 東京医科歯科大学, 統合研究機構, 教授 (50292850)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 侵襲性歯周炎 / 免疫応答 / NOD2 / 口腔内細菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
侵襲性歯周炎の原因遺伝子NOD2の5種類の変異型を293T細胞に導入し、細菌の構成因子であるlipopolysaccharide (LPS)、muramyl dipeptide (MDP)、慢性歯周炎の原因菌として知られるP. gingivalis (P.g.) および侵襲性歯周炎患者で高頻度に観察されるA. actinomycetemcomitans (A.a.) の細胞破砕液に対する免疫応答を確認した。その結果、MDPとP.g.菌、A.a.菌破砕液に対して何種類かのNOD2変異型で免疫応答の亢進が観察された。
このような免疫亢進が、活性化したNOD2によるself-inductionの結果によるものであるかを確認するため、MDP添加後のNOD2発現量をwestern blotおよびRT-qPCRにて解析したところ、各変異型の定常時およびMDP添加後の時系列において、有意な発現量の差は確認されなかった。
また、MDP添加後のNOD2の細胞内局在を免疫染色にて確認したところ、各変異型の定常時およびMDP添加後の時系列において、有意な違いは観察されなかった。
各NOD2変異型と結合している因子を免疫沈降によって回収し、SPS-PAGEにて確認したところ、野生型と比較して、各変異型で異なるサイズのバンドは確認されなかった。以上のことから、NOD2変異型によって、NOD2の細胞内局在、発現量および相互作用する因子の種類には大きな変化は起きていないことと、免疫刺激に対する応答性には違いがみられることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
NOD2変異型がマクロファージおよび破骨細胞への分化と活性にどのように影響するかを明らかにするため、マウスマクロファージ様細胞Raw264.7へのNOD2変異型導入を試みている。レンチウイルスを用いて、EFプロモーターの下流につないだ変異型NOD2遺伝子を導入したものの、ゲノムへNOD2が挿入された薬剤耐性細胞が取得できたにも関わらず、mRNAおよびタンパク質レベルでのNOD2発現が確認できなかった。
免疫系細胞に免疫系の調整因子NOD2を過剰発現させている状態が、細胞にとって都合が悪いのではないかと考え、tet-on systemを用いた遺伝子組み換えを実施してみたものの、やはりNOD2の発現を達成できなかった。現在実験系の最適化を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
NOD2変異型遺伝子の安定発現株を免疫系細胞で取得するのに難航している。EFプロモーターによる過剰発現系が不適切であるようなので、low copy number promoterへの切り替えを試みている。具体的にはSV40 promoterおよびUBC promoter の下流にNOD2変異型遺伝子を組み込み、レンチウイルスを用いてRaw264.7への遺伝子導入を行う。ただしこの場合、内在性の野生型NOD2発現によって変異型NOD2の表現型が見えなくなる可能性が考えられるため、そのような場合にはゲノム編集での対応を考える。
また、NOD2変異型と結合しているタンパク因子について、免疫沈降からのSDS-PAGEの結果では、野生型と比較して明確に異なるバンドは確認されなかった。しかし分子量では識別が難しい因子との結合や、結合量、親和性の変化が起きている可能性を考慮して、免疫沈降後の網羅的プロテオーム解析等を実施していきたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
昨年度に計画していた実験の一部がうまくいかなかったため、実験系を変更した。それに伴い、変更しなければならない試薬類が生じると予想されるため、うまくいく実験系が確立できてから必要試薬を購入したいと考え、研究費の一部を今年度への持ち越しとした。
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