2022 Fiscal Year Research-status Report
Effects of AGEs on the relationship of exacerbation of periodontal disease and impairment of gingival epithelial barrier function.
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22K10007
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
鈴木 直人 日本大学, 歯学部, 教授 (10226532)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田邉 奈津子 日本大学, 歯学部, 准教授 (10409097)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 終末糖化産物 / 歯周病 / 歯肉バリア機能 / Claudin |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我が国の糖尿病患者における歯周病重症度が有意に高いことが示されており，1970～2003 年までの報告を調査したメタ解析においても同様な見解が得られている。そこで申請者らは，糖尿病の要因である最終糖化産物(Advanced Glycation Endproducts:AGEs)が歯肉上皮のバリアを破壊することで歯周病原菌が歯周組織に侵襲を加えることが，糖尿病患者における歯周病の重症化の要因の１つではないかと考え，本研究を企図した。具体的には，令和４年度は，ヒト歯肉上皮癌由来株化細胞Ca9-22を用い，細胞のバリア機能に関連するタイトジャンクションを構成するタンパク質の１つであるClaudinの遺伝子発現に及ぼすAGEsの影響を調べた。その前にAGEsのCa9-22細胞への指摘濃度を調べるために予備実験として，0, 50, 100 ug/ml AGEsを添加し細胞増殖を調べた。その結果，培養14日目まで，いずれのAGEs濃度に対して細胞の生存率の低下は認められなかった。そこでAGEsの濃度は0または100 ug/mlに設定し，次に、Claudin 1, 3, 4, 5の遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。AGEsは培養３日目でClaudin 1, 3, 4, 5それぞれの遺伝子発現を有意に減少させた。これらの結果は，AGEsが歯肉上皮細胞のバリア機能を低下させている可能性が示唆された。
歯周病の悪化とAGEsの関係を調べるために，歯周病原因菌であるグラム陰性菌の内毒素であるLPSでCa9-22細胞に炎症を惹起させたときのAGEsの影響を調べた。LPSとAGEsの共刺激は炎症性サイトカインIL-1,TNFαおよびPGE2合成酵素COX2の遺伝子発現を著しく上昇することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書に記載した令和４年の研究計画の以下の５項目について実験を実施した。
①歯肉上皮細胞には歯肉上皮癌由来株細胞(Ca9-22)を用いる。②AGEs の作製：AGEs の作製は先行研究に準じて行う。すなわち，10 g ウシ血清アルブミンと1.8g DL-グリセルアルデヒドに0.4g ジエチレントリアミンペンタメトリック酸を200mL の生理食塩水と混合し，37℃で7 日間浸透させて作製する。③AGE 刺激：Ca9-22 がコンフルエントになった時点で，0，50，100 および200 mg/mL 濃度のAGEｓで24，48 時間刺激する。④real-timePCR：細胞間接着に関与するClaudin，Occludin およびJAM-A の遺伝子発現に及ぼすAGEs の影響を調べる⑤Cell culture insert とFITC-dextran を用いた透過実験を行い，歯肉上皮バリア破壊への影響を直接調べる。令和4年度は④までの実験が終了している状況である。
よって当該年度は，おおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，令和4年度に計画しまだ実験の実施に至っていない⑤Cell culture insert とFITC-dextran を用いた透過実験を行い，歯肉上皮バリア破壊への影響を直接調べること，申請書の研究計画書に記載した「動物実験を用いた検討，細胞生物学的・分子生物学的研究の継続」について実施する予定である。細胞生物学的・分子生物学的研究の継続については，AGEsがCa9-22細胞のClaudin 1, 3, 4, 5のタンパク発現に及ぼす影響と、AGEs受容体RAGEのアンタゴニストFMS-ZM1を用いて、AGEsとClaudin発現における分子メカニズムの検索とLPS誘導性の炎症性サイトカイン発現に及ぼすAGEsの影響について調べる実験を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由としては当該年度に必要な実験試薬や器具を購入していたが，効率よく必要な試薬をより多く手に入れるために物品購入時にキャンペーンなどを利用し購入し，計画的に研究費を使用しようと心がけていたため費用が抑えられたと考えられる。次年度使用額と令和5年度助成金を合わせて引き続き当該研究の為の研究試薬および器具の購入を主とし，加えて研究成果を学会発表する為の旅費として使用したいと考えている。
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