2022 Fiscal Year Research-status Report

Development of therapeutic agent for Graft-versus-host-disease using conditioned media collected prepared by culturing dental pulp stem cells on frozen organ disease section

Research Project

Project/Area Number	22K10182
Research Institution	Tsurumi University
Principal Investigator	舘原誠晃鶴見大学, 歯学部, 講師 (90380089)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	井出信次鶴見大学, 歯学部, 助教 (00611998) 竹部祐生亮鶴見大学, 歯学部, 助教 (50807097)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Keywords	再生医療 / 難治性炎症疾患 / 歯髄幹細胞
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、慢性移植片対宿主病:Graft-versus-host-disease (GVHD)などの免疫過剰反応疾患に対して歯髄幹細胞が有する再生環境整備機能の有用性を検討することである。本年度では、まず歯髄幹細胞を購入し、その特性についてフローサイトメトリーにて歯髄細胞の細胞膜抗原および分化能を評価した。この結果、これらの細胞は間葉系幹細胞のマーカーの発現を認め、さらには骨、軟骨、脂肪への分化能を有していた。これらの結果から購入した歯髄幹細胞が間葉系幹細胞であることを確認した。次にGVHD疾患モデルマウスの凍結肝臓切片を作製し、この切片上で歯髄幹細胞の培養を行ったが、切片上への細胞の接着が不均一となり、培養条件が一致しなかったため、再現性のある結果を得ることができなかった。そこで慢性GVHDの組織内では免疫関連因子であるIFN-γを発現した陽性細胞が存在するとの報告から、INF-γ存在下に歯髄幹細胞を刺激することにより、歯髄幹細胞が有する再生環境整備機能や免疫寛容機構に関連した液性因子が産生されるとの仮説を立てた。IFN-γによる刺激時期と投与濃度は、過去の研究報告を参考に設定した。実際には歯髄幹細胞を80%コンフルエントまで培養し、この時点でIFN-γを200 ng/mlを培養液に加えて24時間培養後、新鮮培養液に交換し、さらに24時間培養後に培養上清を回収した。現在、回収した培養上清を抗体マイクロアレイ解析にて免疫関連因子の産生量を測定している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 社会情勢による研究備品の入手困難や価格高騰、また研究者や研究協力者のコロナ感染に伴い、研究が停滞し、研究計画から大幅に遅れをとった。さらに研究手技が安定しないため、結果に再現性を認めなかったことも遅れの原因となっている。しかしながら、計画を一部変更することにより対応できたため、次年度では計画通りに遂行可能である。
Strategy for Future Research Activity	当初の研究計画通り、歯髄幹細胞が産生する液性因子により免疫過剰反応に関連する疾患に対する新規治療薬の開発を行う予定である。しかしながら、慢性GVHDモデルマウスの肝臓と腎臓の凍結切片上での歯髄幹細胞の培養に問題を生じた。そこで、凍結切片の代用として、炎症組織内で高く発現している免疫賦活因子であるIFN-γ存在下に歯髄幹細胞を培養し、その培養上清を治療薬としての有用性を検討することにした。現在、IFN-γ刺激下に培養した歯髄幹細胞が産生する液性因子を解析している。この結果により培養上清中の免疫抑制因子の産生が確認されれば、この培養上清を慢性GVHD疾患モデルマウスへの投与する予定である。現在、その研究の準備を行なっているところである。次年度では、IFN-γにて刺激した歯髄幹細胞の培養上清をGVHDモデルマウスに静脈投与後、マウスの肝臓、腎臓、唾液腺（顎下腺）および口腔粘膜を組織学的に評価し、その効能を評価する予定である。
Causes of Carryover	社会情勢による研究備品の入手困難や価格高騰、また研究者や研究協力者のコロナ感染に伴い、研究が停滞してしまった。また当初計画した研究結果が安定しなかったことも影響した。これらのことから予定した支出額が大幅に減少した。次年度では、動物を用いた研究が主となるため、疾患モデルマウスの購入費、その飼育費、組織学的解析に利用する抗体等の試薬購入に使用する予定である。また、良好な研究成果が出た際には、研究成果を国内学会・研究会等にて発表するため出張費にも使用する予定である。