口腔潜在的悪性疾患のフローラ異常による悪性転化機構の解明と予防法の確立

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K10204
• Research Institution: The Nippon Dental University
• Principal Investigator: 岡田 康男 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 教授 (40267266)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大野 淳也 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 助教 (90779787) ; 戸谷 収二 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 教授 (20287791) ; 小根山 隆浩 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 講師 (40350160)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 口腔細菌叢（フローラ） / 口腔潜在的悪性疾患 / 口腔癌 / 口腔細菌叢のバランス破綻 / 免疫組織化学 / p53ロス

Outline of Annual Research Achievements

口腔潜在的悪性疾患や癌患者における口腔細菌叢（フローラ）のバランス破綻により正常細胞や組織構造に変化をきたす機構と潜在的悪性疾患や口腔癌の発生に関与する機序について明らかにすることを目的として細菌を採取した．採取したのは 口腔潜在的悪性疾患や癌患者30例における病変部各1検体と非病変部（舌背）各1検体の計60検体とコントロール10例の舌背部10検体で，総計70検体である．これらについてDNA塩基配列・分子系統解析（16S rRNA）により，菌種，量，分子系統解析およびその複雑な構成割合を明らかにするために，これまで口腔内細菌のDNAを抽出し，可変領域（V3-V4）のPCR増幅を行い，ライブラリー化，ライブラリー調整および次世代シーケンサーにより塩基配列を取得した．また，対象症例の口腔癌・前駆病変30例における生検組織ブロックを用いて組織・細胞の変化とその機構および細胞増殖能について明らかにするためにH-E染色病理組織像から抽出した切片部分について，角化異常に関してはCK13とCK17，がん抑制遺伝子に関してはp53とp21，細胞増殖能に関してはKi-67および上皮間葉転換に関してはE-CadherinとN-Cadherinの免疫組織化学染色を行い，解析を行っている．
現在までのところ，採取した細菌のDNA塩基配列・分子系統解析（16S rRNA）により，コントロールに比べ病変部において細菌叢の違いを確認している．また，生検組織ブロックの生検組織のH-E染色病理組織像により，角化の違いを確認し，免疫組織化学染色により，p53の発現を認めない検体（p53ロス）が散見されている．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定した口腔潜在的悪性疾患や癌患者30例における病変部各1検体と非病変部（舌背）各1検体の計60検体とコントロール10例の舌背部10検体の細菌採取を行い，合計70検体のうち病変部30検体とコントロール10検体の合計40検体についてDNA塩基配列・分子系統解析（16S rRNA）を行い，評価できたこと．また，対象症例30検体の免疫組織化学染色を行い，評価できたため．

Strategy for Future Research Activity

これまでに得られた結果について学会で発表し，その後，口腔潜在的悪性疾患や癌患者の病変部と非病変部の採取細菌についてDNA塩基配列・分子系統解析（16S rRNA）を評価，検討し，さらに，特定の増減する細菌の培養抽出液で口腔癌細胞の変化や増殖抑制・促進を確認するためにin vitro実験をおこなう予定である．

Causes of Carryover

細菌のDNA塩基配列・分子系統解析（16S rRNA）の検体数が多くなり，当初予定額より約27万円増加したが，免疫組織化学染色については本補助金交付前に予備的に行った際の一次抗体，二次抗体，試薬，ガラス器具およびプラスチック器具の残余分を使用していたことにより次年度使用額が生じたが，これらの抗体，試薬および器具は無くなりつつあるため順次購入する予定である．