2022 Fiscal Year Research-status Report
Usefulness of nucleic acid amplification in search for responsible bacteria for sepsis.
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22K10622
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
副島 美貴子 久留米大学, 医学部, 准教授 (80279140)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神田 芳郎 久留米大学, 医学部, 教授 (90231307)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 敗血症診断 / 核酸増幅 / ethidium monoazide処理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
法医解剖事例は、検体採取時のコンタミネーションに加え、腐敗細菌や腸内細菌の増殖などの法医試料に特徴的な要因で、死体試料から特定の細菌が分離、同定されたとしても、それが原因菌であると断定できないという問題があり、敗血症を確実に診断することは難しい。しかし、同定された菌種による感染と解剖・検査所見との間に整合性が確認されるケースもあり、原因菌として矛盾しない微生物の存在の証明は法医診断に有用である。本研究計画では、viability PCR法（生細菌を選択的に増幅するPCR法）を利用した増幅法や核酸抽出法の検討をおこない、法医領域での敗血症原因菌の検索における核酸増幅の有用性を検証する。
今年度は、過去の敗血症が疑われた解剖事例に同定された菌種をリスト化し、主要な菌種の純培養菌を購入し、これらを用いて生菌・死菌の分別条件の検討をおこなった。分別には、死菌由来DNAをDNA修飾色素であるEMA (ethidium monoazide)を用いて修飾することでPCR増幅を抑制し生菌由来DNAのみ検出する方法を用いた。EMA処理は、細菌にEMAを含む試薬を添加し浸透させた後、光照射（精度の高い安定したデータ取得が可能な専用装置を本研究費で購入した）するとEMAによりDNAが化学修飾される。純培養菌の生菌と死菌を準備し、EMA処理の時間や回数、EMA濃度を変えて、それぞれの菌種について、最適な死菌抑制効果が得られるEMA処理条件の検討をおこなった。死菌は、熱処理により膜を損傷することで調整し、DNAを抽出、確認は16S rRNA のPCR増幅によりおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでに経験がないこともあり、死菌の調整がうまく行かなかったこと、さらにEMA処理の条件検討に時間を要した。また、他の業務による時間的制約によりエフォートの低下をきたした。
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| Strategy for Future Research Activity |
純培養菌を用いた条件検討を継続し、条件検討が進んだ時点で、症例サンプルについての解析（①分離培養検査、核酸増幅の２法（②死菌/生菌を問わず増幅するEMA処理をしないPCR、③生菌由来DNAのみを選択的に増幅するEMA-PCR法）を始める。
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| Causes of Carryover |
前述の通り、研究計画の遅延が次年度使用の生じた主な理由である。本研究は最適な検査条件の検討と設定が主要な到達目標であるため、当初の計画でも次年度も引き続き実施する項目であり、大きな変更は生じないものと考えている。
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