炎症・免疫応答を司る骨格筋特異的メカニカルストレス受容体の新規同定と機能解析

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K11505
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 佐々木 文之 日本医科大学, 医学部, 助教 (10706469)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2027-03-31
• Keywords: メカノバイオロジー / 骨格筋 / IL-6 / 炎症 / メカノセンサー / マイオカイン / イオンチャネル

Outline of Annual Research Achievements

我々は、適度な運動が様々な臓器・組織の炎症を抑制し、免疫機能を向上させる効果を有すること、一方で過度な筋力トレーニングなど激しい運動は過剰な炎症及び免疫機能の低下を引き起こすことを経験的に理解している．しかし、未だにその分子機序の全容解明には至っていない。本計画では、メカニカルストレス刺激により骨格筋から分泌されるタンパク質、IL-6を指標とした高感度スクリーニング法を独自に構築し、これを用いて骨格筋特異的に発現している新規メカニカルストレス受容体の同定とその機能解析を試みる。令和５年度も、CRISPR/Cas9法を用いた内因性IL-6を検出するレポーター細胞の樹立およびスクリーニングの着手を計画した。
これまでのところ、伸展圧縮装置を用いた培養系の立ち上げとして、専用チャンバー上でのマウス骨格筋由来筋芽細胞株C2C12の骨格筋細胞への分化および、伸展圧縮刺激後の培養上清中のIL-6の測定に成功している。一方で、CRISPR/Cas9法によるC2C12のIL-6遺伝子座へのレポーター遺伝子導入（HiBiTまたはEGFP）にやや時間を要している。またスクリーニングで使用する材料のツールの準備は予定通り進んでいる。また本細胞を用いていくつかの受容体やイオンチャネルに対するアゴニストの刺激後、IL-6の測定を行った。その結果、既に報告されているイオンチャネルと同程度のレベルで、まだ報告されていない新たなイオンチャネルによるIL-6産生経路の発見に成功した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CRISPR/Cas9法を用いたC2C12のIL-6遺伝子座へのレポーター遺伝子導入にやや時間を要している理由として、crRNAによる切断効率やcrRNA/Cas9 complexの導入効率が低いためと考えられる。作製したdonor DNAの配列（特にホモロジー配列）にも問題がある可能性がある。
また本細胞を用いていくつかの受容体やイオンチャネルに対するアゴニストの刺激後、IL-6の測定を行った。その結果、既に報告されているイオンチャネル（Piezo1など）と同程度のレベルで、まだ報告されていない新たなイオンチャネルによるIL-6産生誘導機序の発見に成功している。

Strategy for Future Research Activity

切断効率の高いcrRNAの選別やより良いcrRNA/Cas9 complexの導入方法の検討を行う。作製したdonor DNAの配列、特にホモロジー配列についても検証する。また、IL-6翻訳領域上流のプロモーター/エンハンサー領域をクローニングし、その直下にレポーター遺伝子を繋いだ配列を含むコンストラクトを作製、本配列を導入したC2C12の樹立も並行して行うことも計画している。
さらに、まだ報告されていない新たなイオンチャネルによるIL-6産生誘導機序に着目し、本イオンチャネルの遺伝子欠損細胞やマウスの樹立及びin vivo、in vitroでの解析を行う。